单细胞RNA测序技术在胶质母细胞瘤研究中的应用*

宋 萍, 邓 慧, 张孟贤

华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤科,武汉 430022

胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是最常见的中枢神经系统原发恶性肿瘤,约占后者的48%[1]。GBM诊断中位年龄为65岁左右,全球每年每10万人中有3～5人患病,男性多于女性[2]。既往对GBM的诊断主要基于其组织病理学特征,如坏死和微血管增生。世界卫生组织2021年提出,LDH野生型星形细胞瘤即使没有高级组织病理学特征,当存在至少一个以下分子特征:如并发7号染色体扩增或10号染色体缺失、EGFR扩增或TERT启动子突变,也可以诊断为GBM[3]。由此提高了分子诊断在GBM诊断中的地位。目前GBM患者的标准治疗方案包括最大限度的手术切除辅助替莫唑胺化疗联合放疗,诊断后的中位总生存期约为14.6个月,几乎所有GBM患者在治疗后均会复发,其5年生存率约为5%[4]。肿瘤治疗电场(tumor treating field,TTF)联合标准治疗方案或联合替莫唑胺治疗新发GBM,可显著提高患者的生存率[5]。而GBM的免疫治疗、靶向治疗以及复发GBM的TTF治疗尚未见有明显疗效的报道。

传统整体转录组测序主要反映数千个细胞的平均基因表达,没有考虑到样本中各个细胞基因表达的异质性。而单细胞测序是从单个细胞的水平上,对基因组、转录组、表观基因组等进行测序分析的技术,主要涉及单细胞基因组学测序、单细胞蛋白组学测序、单细胞转录组学测序、以及单细胞表观基因组测序等。单细胞转录组测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)可在单个细胞的分辨率下解析基因的表达,是研究细胞异质性及探索肿瘤发生、发展及转移相关的细胞类型等方面的有利选择[6]。其基本流程包括:单细胞分离和捕获、细胞裂解、逆转录(将其RNA反转录为cDNA)、cDNA扩增和文库制备[7]。2009年对哺乳动物小鼠的单胚层和卵母细胞进行了scRNA-seq[8],是世界上第一例单细胞测序。当时仅能检测少量细胞,且成本高昂,限制了这种技术的大规模使用。随着单细胞测序技术的不断成熟,已经有几十种不同的测序技术被研究出来。2015年,Drop-seq[9]以及inDrop[10]两种技术将微流体技术和scRNA-seq相结合,Cyto-seq将微孔板技术与scRNA-seq相结合,使快速、低成本地分析数千个细胞的基因表达成为可能。2017年以来,分别基于Drop-seq和Cyto-seq原理的10X Genomics Chromium以及BD Rhapsody测序平台相继问世,标志着低成本的商业化单细胞转录组测序技术时代的到来。除了这些技术,Smart-seq[11]、MARS-seq[12]、Microwell-seq[13]等技术也在被使用,其中Smart-seq技术能够得到全长的转录本,但其局限性为低通量、高成本,近年来科学家们在此技术的基础之上不断进行改进,开发出了Smart-seq2[14]、Smart-seq3[15]技术,不断降低测序成本,提高样品处理量。目前scRNA-seq技术已经开发出许多分析方法,主要包括数据预处理、一般分析和探索性分析。数据的预处理包括质控、比对和量化;一般分析包括低质量细胞过滤、归一化、高度可变基因选择、降维、聚类和细胞类型注释;探索性分析包括差异基因分析、功能富集、基因集变异分析、转录因子预测、细胞轨迹、细胞-细胞相互作用、细胞周期和空间转录组分析[16]。

在GBM领域,基于scRNA-seq的研究有很大的进展。2014年Patel等[17]对5例GBM样本进行scRNA-seq,揭示了GBM内肿瘤细胞转录组的多样性,此后越来越多的关于GBM的scRNA-seq研究不断开展,包括通过对GBM中的细胞进行聚类以鉴定出具有在特征基因、生物学特性、预后等方面具有差异的肿瘤细胞群体[17-20],鉴定出分布于肿瘤不同部位、出现于肿瘤发展过程中不同时段、具有不同作用的免疫细胞群体[21-24];分析癌细胞的发展轨迹以确定GBM肿瘤细胞的来源[25-27];利用基因间的表达相关性和基因的聚类来构建基因调控网络[20,28-30];在GBM治疗方面,通过对治疗前后免疫微环境的分析,提出解决耐药问题以及增加治疗敏感性的潜在靶点[31-36]。总之,scRNA-seq技术具有阐明肿瘤发生发展机制的巨大潜力,有利于肿瘤的个体化治疗以及优化各种治疗方案,为GBM的精准治疗策略提供新的思路。

1 scRNA-seq探索肿瘤异质性

肿瘤异质性是指肿瘤演进过程中分子生物学及基因方面发生的改变,从而使不同肿瘤细胞的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性等产生差异[37]。GBM的异质性不仅体现在不同的患者之间,也存在于同一患者的肿瘤细胞之间,其异质性由多种因素共同驱动,如遗传、表观遗传和微环境等[38]。不同患者的肿瘤具有不同的染色体畸变,每个患者的肿瘤细胞都有一组独特的小范围突变,这些突变划分了每个肿瘤中不同的肿瘤细胞群[25]。

1.1 GBM的个体间异质性

scRNA-seq揭示不同患者个体间分子及免疫浸润情况的差异。既往的整体转录组研究显示GBM具有显著的瘤间异质性,GBM可以被定义为4个亚型:前神经亚型(proneural subtype,PN)、经典亚型(classical subtype,CL)、间充质亚型(mesenchymal subtype,MES)、神经亚型(neural subtype,NE)[39]。Wang等[40]通过对单细胞公共数据库中的数据进行分析得出结论,NE可能是肿瘤边缘正常组织污染,因此将其排除在外。其余3个肿瘤亚型的基因表达、免疫微环境、肿瘤的生物学行为以及预后都不尽相同,PN、MES和CL亚型分别与血小板源性生长因子受体(platelet derived growth factor receptor,PDGFRA)、Ⅰ型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type1,NF1)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor,EGFR)的基因表达异常相关联,CL和MES具有更高的侵袭行为,而PN具有相关良性行为[39]。MES评分高的患者伴随着肿瘤微环境中丰富的巨噬细胞、T细胞和内皮细胞浸润[40]。一项基于单细胞公共数据库的scRNA-seq研究显示,不同亚型的细胞在同一患者体内的分子相似性大于同一亚型细胞在不同患体内的分子相似性,肿瘤细胞的拷贝数变异(copy number variation,CNV)状态和调控网络在同一患者中更加具有相似性,这表明肿瘤的瘤间异质性比瘤内异质性更明显[27]。

1.2 GBM肿瘤细胞间的异质性

通过scRNA-seq可以鉴定同一患者肿瘤内不同状态的肿瘤细胞以及不同状态肿瘤细胞之间基因、侵袭能力、肿瘤微环境的差异。2019年Neftel等[18]对20个成人和8个儿童GBM的共24131个细胞进行scRNA-seq,发现GBM中的恶性细胞以神经祖细胞(neural progenitor cell,NPC)样、少突胶质祖细胞(oligodendrocyte precursor cell,OPC)样、星形胶质细胞(astrocytes cell,AC)样和间充质细胞(mesenchymal,MES)样的状态存在。EGFR突变与AC样状态的相对丰度有关,CDK4和PDGFRA的扩增分别与NPC样和OPC样状态的丰度相关,而Chr5q的缺失、NF1的改变、大量免疫浸润和缺氧则影响MES样状态的频率。AC样状态与MES样状态分别对应MES、CL亚型,在PN的富集评分中,NPC样和OPC样状态没有显著差异。NPC样状态是处于增殖状态的细胞,可能是肿瘤细胞的起源。MES样状态中上皮间充质转化相关基因上调,诱导免疫介质,表达高水平的免疫因子,在免疫抑制的微环境中起重要作用,从而促进肿瘤的增殖[24]。一项scRNA-seq研究鉴定了3种不同类型的MES样状态,分别为缺氧相关的MES样状态(hypoxia-related,MES-Hyp)、星形胶质细胞相关的MES样状态(astrocyte-related,MES-Ast)以及二者的中间状态。这种不同状态的形成可能与异常的免疫微环境相关。MES-Hyp优先与NF1缺失、整体巨噬细胞丰度、巨噬细胞/小胶质细胞比值和M2相关的巨噬细胞相关。相反,MES-Ast与T细胞丰度和细胞毒性相关[41]。

1.3 GBM的时空异质性

肿瘤的时空异质性是指肿瘤细胞亚群在疾病部位之间和内部的遗传差异不均匀分布以及癌细胞分子组成的随时间变化而变化[37]。既往根据多区域采样的整体转录组研究同一个体的肿瘤可为多个亚型混合模式,亚型可以随时间的推移而发生改变[39]。而scRNA-seq研究单个细胞的状态,每个肿瘤都是由处于多种细胞状态的细胞组成的,这些细胞可能会增殖或过渡到其他状态,这是由于某些遗传因素决定了特定的过渡速率,进而定义了一个稳态分布[18]。He等[20]发现癌细胞从周期细胞向NPC/OPC样状态再向MES样状态进化,这表明GBM癌细胞的动态进化驱动了胶质瘤的肿瘤内异质性。Wang等[26]的研究揭示两种胶质瘤干样细胞类型:前神经干样细胞型(proneural glioblastoma stem-like cells,pGSCs)、间充质干样细胞型(mesenchymal glioblastoma stem-like cells,mGSCs)。pGSCs在肿瘤前沿和浸润区域富集,mGSCs在肿瘤核心中更富集。这两种干细胞处于同一个变异轴上,间充质干细胞为前神经干细胞的祖细胞。间充质干细胞型在缺氧区富集,与不良预后相关,而前神经干细胞型则无法预测预后。Xiong等[27]结合Verhaak等[39]及Wang等[26]的scRNA-seq相关研究将肿瘤细胞分为PN、MES、CL、mGSCs以及pGSCs共5种类型,mGSCs来源于ME和CL亚型,而pGSCs主要来源于PN亚型,RNA速度显示GSC亚型从间充质表型转变为神经前表型。Lee等[19]利用scRNA-seq分析了来自多个位置和不同时间点的肿瘤细胞,多灶性肿瘤比局部邻近肿瘤更具有遗传多样性,表现出空间遗传异质性。肿瘤的核心比肿瘤边缘有更多的缺氧和粘附相关基因,肿瘤核心往往有大量具有增殖功能的细胞,且肿瘤的核心和肿瘤边缘各种肿瘤细胞状态和免疫细胞的比例也不同[22]。因此scRNA-seq揭示了GBM肿瘤内不同不部位分布着不同状态肿瘤细胞,以及这些细胞之间的演变。

2 scRNA-seq描述肿瘤免疫微环境

肿瘤免疫微环境包括肿瘤细胞、免疫细胞、细胞因子、细胞外基质(extracellular matrix,EMC)等。这些免疫细胞分为抗肿瘤和促肿瘤成分,它们之间的相互作用决定了抗肿瘤免疫的趋势[42]。抗肿瘤免疫细胞主要包括效应T细胞(包括细胞毒性CD8+T细胞和效应CD4+T细胞)、自然杀伤细胞(natural killer cells,NK细胞)、树突状细胞(dendritic cells,DCs)和M1相关巨噬细胞。促瘤免疫细胞主要为Treg细胞、髓系抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)、M2型巨噬细胞等。在GBM肿瘤微环境中,大多数免疫细胞是肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs),占细胞总数的30%～40%[43],T细胞占细胞总数不到0.23%[44]。

2.1 肿瘤相关巨噬细胞

scRNA-seq研究描述了GBM中肿瘤相关巨噬细胞的异质性。GBM中的TAMs由两种细胞群组成:常驻小胶质细胞和骨髓来源的巨噬细胞,前者占15%,后者占85%[45],近期的scRNA-seq研究发现,两者在肿瘤核心和周边以及新发和复发的GBM中分别占有不同的比例。常驻小胶质细胞和骨髓来源的巨噬细胞分别优先占据具有促炎标志物表达的瘤周间隙和具有抗炎标志物及促血管生成因子表达的肿瘤核心[22]。在新诊断的GBM中常驻小胶质细胞占主导,但在复发的GBM中骨髓来源的巨噬细胞比例增加并占主导地位,尤其在缺氧的环境中,表达促炎细胞因子[46]。Cui等[38]通过scRNA-seq描绘了肿瘤免疫微环境肿瘤相关巨噬细胞的启动和抑制状态,TCGA不同的亚型中可以观察到不同状态的TAMs,几乎所有的TAMs都是骨髓来源的巨噬细胞,在CL亚型肿瘤中,抑制的小胶质细胞占大部分,而在PN亚型中主要为抑制的巨噬细胞和启动的小胶质细胞,二者各占40%。近期一项研究使用scRNA-seq描绘了4种类型的TAMs,TAM-0与细胞因子的产生及脂蛋白的代谢相关;TAM-2过表达细胞周期相关基因;TAM-3高表达干扰素应答基因;TAM-1对缺氧有反应,并与MES样细胞具有显著关联[24]。另一项scRNA-seq相关研究显示小胶质细胞和单核/巨噬细胞均可进一步分为不同功能的亚型,还发现男性患者中,小胶质细胞和部分单核细胞/巨噬细胞的MHCⅡ基因比女性表现出更强的表达上调,这可能是免疫治疗对男性患者疗效更好的原因之一[47]。

2.2 其他免疫细胞

scRNA-seq研究显示多种免疫细胞在GBM中表现为免疫抑制状态,并初步探讨了相关机制。T细胞常定位于GBM的浸润边缘和血管周围[48],常常高表达一些标记物如:PD-1、LAG-3、TIM-3和IDO,使其成为无功能或耗竭亚群[49]。Ravi等[50]通过scRNA-seq鉴定出6种CD4+T细胞亚群和6种CD8+T细胞亚群,证实了CD8+T细胞和小部分CD4+Th17样细胞最终分化为衰竭T细胞,髓系细胞通过释放IL-10介导T细胞功能障碍。与外周血相比肿瘤病变部位的Treg细胞和衰竭T细胞的比例增加[49]。scRNA-seq研究显示肿瘤组织中的NK细胞,与外周血相比获得了溶解功能降低相关改变的表型,使其失去细胞毒作用[49,51]。MDSCs是一种未成熟的髓系细胞,具有免疫抑制和肿瘤促进特性,相比于早期,晚期GBM免疫微环境中的MDSCs数量增加[23]。Yeo等[23]发现一个高度增殖的GBM相关小胶质细胞群体,它可能在激活GBM患者的紧急骨髓生成和招募MDSCs到GBM免疫微环境中发挥决定性作用。

2.3 非免疫细胞

scRNA-seq研究显示非免疫细胞及ECM也在肿瘤的免疫微环境中发挥一定的作用。既往研究表明ECs可定义为两大类,一类是肿瘤衍生内皮细胞(tumor derived endothelial cells,TDECs),另一类是肿瘤相关血管(tumor associated vessels,TAVs),Carlson等[52]通过scRNA-seq描绘了这两类ECs不同的分子特征。在对TAV轨迹分析中发现TAV从促血管生成的ECs向静止的、内稳态的ECs过渡。TDECs由两个不同的内皮亚群组成:TDBECs和TDLECs,TDBECs具有丰富的血管发育特征,而TDLECs具有促炎和淋巴细胞特征。透明质酸(hyaluronic acid,HA)作为ECM的主要成分,不仅可以干预巨噬细胞的招募和浸润还可以调节PD-L1的表达,从而促进免疫抑制的微环境[46]。

3 scRNA-seq挖掘瘤内细胞间的通讯

3.1 间充质转化相关通路

MES亚型相对于其他亚型具有更强的侵袭性,而肿瘤微环境中存在许多通路使肿瘤细胞向MES亚型转变,scRNA-seq技术可对这些通路进行预测。一项scRNA-seq研究发现SPP1基因主要在巨噬细胞中表达,CD44主要在MES样细胞中表达,所有细胞间相互作用中,巨噬细胞与MES样细胞之间SPP1/CD44的相互作用强,由此可以推测SPP1/CD44细胞通路在肿瘤细胞转化间充质状态的过程中发挥了重要的作用[20]。Hara等[30]通过对肿瘤模型进行scRNA-seq,结合功能实验发现,肿瘤相关巨噬细胞衍生的抑癌素M(oncostatin M,OSM)与GBM细胞上的GP130复合物的受体(OSMR或LIFR)相互作用并激活STAT3,从而诱导了GBM的间充质状态。另一项scRNA-seq研究发现来自髓系细胞的非转移性糖蛋白B(glycoprotein nonmetastatic B,GPNMB)可与大多数间充质靶点相互作用。GPNMB高表达巨噬细胞亚群作为细胞通信的枢纽,不仅诱导PN向MES肿瘤细胞的转化,还与树突样细胞竞争而损害T细胞的活化。因此靶向GPNMB可以增加T细胞活化,抑制肿瘤细胞向间充质转化,有利于创造一个对肿瘤治疗有益的微环境[29]。由此可见,肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤的间充质转化中发挥着巨大的作用。

3.2 免疫微环境相关通路

通过scRNA-seq,在肿瘤细胞与肿瘤相关巨噬细胞之间观察到10对配体-受体促进肿瘤相关巨噬细胞M2型极化,从而引发抗炎反应及促肿瘤属性[24]。Yeo等[23]建立GBM小鼠模型,发现肿瘤免疫微环境中大部分的细胞因子及其受体都存在于免疫细胞而非肿瘤细胞中,Cxcl12阳性内皮细胞和Cxcr4阳性MDSCs之间的潜在回路,可能促进了髓系抑制性细胞的募集和浸润,从而导致了免疫抑制的微环境。Zhang等[46]研究GBM免疫微环境中肿瘤的代谢模式时发现,透明质酸通过IL-1/CHI3L1轴和TGF-β/CHI3L1轴参与巨噬细胞的浸润和募集。HA还可调节PD-L1的表达,促进免疫抑制微环境。另一项整体RNA测序结合scRNA-seq研究显示MET过表达有助于STAT4/PD-L1通路的激活,从而使肿瘤相关巨噬细胞抗炎介质和血管生成相关基因的表达显著升高,而促炎介质的表达水平降低[28]。除此之外,T细胞与髓系细胞、肿瘤相关巨噬细胞之间的相互作用,往往导致T细胞功能损害,从而营造了一个促肿瘤的免疫抑制的微环境[29,50]。

4 scRNA-seq在GBM治疗中的应用

4.1 免疫治疗

scRNA-seq可以预测使T细胞功能抑制或者增强的靶点。免疫治疗为癌症治疗提供了一种新的选择,其中程序性死亡配体1(programmed death ligand-1,PD-L1)和程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)轴已被证实可以有效地帮助癌细胞逃避免疫系统。GBM对免疫治疗具有明显的耐药性,一项scRNA-seq显示抗PD-1治疗后,髓系细胞高表达T细胞抑制检查点,从而阻止了肿瘤浸润性T细胞的激活[31]。Chen等[53]发现MARCO高表达亚群与间充质、缺氧、抗炎特征以及不良预后相关。GBM在长期抗PD-1免疫治疗过程中,MARCO的表达明显下降,预示着MARCO(+)巨噬细胞可能不利于检查点免疫治疗,在未来抗PD-1和靶向MARCO联合治疗可能是一个提高免疫治疗效果的新方向。Goswami等[32]发现高表达CD73的巨噬细胞的特征基因与GBM的生存呈负相关,对比7例未经治疗的GBM样本及5例经过抗PD-1治疗过的GBM样本,抗PD-1治疗并没有改善CD73高表达所导致的T细胞浸润不佳的免疫微环境,而CD73-荷瘤小鼠联合抗PD-1以及抗CTLA-4治疗,其免疫微环境中免疫刺激性巨噬细胞及T细胞比例增加。MES状态免疫微环境中含有更多的浸润性T细胞,因此肿瘤的MES状态可能对免疫治疗具有更好的反应[30]。

4.2 靶向治疗

scRNA-seq可以揭示不同类型肿瘤细胞对不同靶向药物的敏感性,解释靶向药物耐药问题。Alhalabi等[54]建立了一个PDGFRA扩增的GBM模型,结合scRNA-seq发现,其胰岛素受体底物-1和底物-2(IRS1和IRS2)位点的拷贝数扩增,使得达沙替尼存在时肿瘤仍然能够快速生长。另有研究表明MES亚型或MES样细胞内过表达原癌基因激酶(proto-oncogene kinase Src,SRC)的激活特征,因此MES亚型能够更好地响应SRC抑制剂达沙替尼的治疗。前神经GSCs和经典GSCs相比,间充质GSCs对SRC抑制剂更敏感。Liu等[55]发现,GBM中Wnt激活诱导了循环肿瘤细胞的干细胞性和化疗耐药性,这提示靶向Wnt可能为消除GBM治疗中这些难治性细胞提供机会。AKAP12在各种抗VEGFR耐药的肿瘤包括GBM中表达上调,与肿瘤相关成纤维细胞的丰度呈正相关,还与GBM的缺氧、血管生成、转移相关,因此AKAP12与抗VEGF靶向治疗的耐药相关[56]。

4.3 化疗

scRNA-seq可以描绘化疗前后肿瘤免疫微环境的改变。高剂量的替莫唑胺治疗除了直接发挥抗癌细胞作用外,也影响了GBM的免疫微环境,可能通过增加小胶质细胞、减少MDSCs和巨噬细胞的抑制群体,促进CD8+T细胞存活,从而促进促炎表型[23]。Zhao等[57]研究了单个细胞对药物的反应,发现依托泊苷对肿瘤细胞的增殖有影响;而帕诺司他治疗影响肿瘤和非肿瘤群体,诱导了肿瘤细胞中金属硫蛋白家族基因和成熟神经元基因的表达,并显著地重建了肿瘤微环境中的髓系群体,可使小胶质细胞表达的促炎标志下调以及CD168+巨噬细胞减少。由此可见化疗药物不仅可以作用于肿瘤细胞,也导致对肿瘤不利的免疫微环境。

scRNA-seq为解决肿瘤化疗药物耐药问题提供方向。尽管TMZ对分化的GBM细胞有效,但它不能有效地杀死GBM干细胞,被认为是GBM发展的根源。Gong等[36]建立了一个替莫唑胺耐药的GBM模型,发现替莫唑胺耐药肿瘤中含有更多的静止性癌症干细胞(guiescent cancer stem cells,CSCs),这些CSCs表现出较低的自我更新和增殖能力,从而规避常规化疗。在这些CSCs中发现一群NES+/SOX2+/CADM1+三阳性亚群,其耐药性更加显著,可能是由于EGFR的缺乏及其下游通路的减少所导致的,进一步研究表明EGF可提高TMZ耐药肿瘤对TMZ的敏感性。Liu等[58]确定ZNF117是GSC分化的主要调控因子,介导GSC向少突胶质细胞分化,后续结合体内及体外实验验证了这一结论。因此靶向ZNF117的分化治疗联合TMZ化疗,有可能增加GBM化疗的敏感性。

4.4 局部治疗

scRNA-seq研究局部治疗前后免疫微环境的变化。肿瘤切除诱导复发肿瘤细胞中的小胶质细胞/巨噬细胞浸润、血管生成以及几种干细胞相关基因的表达上调。由肿瘤细胞和肿瘤相关的小胶质细胞/巨噬细胞分泌多种营养素(pleiotrophin,PTN),PTN可以诱导肿瘤细胞增殖、自我更新和干细胞程序[59]。Couturier等[33]在对新发和复发GBM进行scRNA-seq时发现,放射治疗可以诱导MES样肿瘤细胞及反应性星型胶质细胞的产生,可能是由免疫细胞在应对肿瘤治疗时产生的促炎症状态所导致的。而这种MES细胞在转录程序上与OPC及星形胶质祖细胞相似,这可能是肿瘤治疗后复发的原因之一。scRNA-seq和整体RNA测序数据集显示,M1和M2巨噬细胞的比例与放疗指数RSI评分之间存在关系,以及放射敏感肿瘤与M1/M2巨噬细胞比例之间存在正相关关系,因此靶向M2型巨噬细胞的治疗可能能增强GBM放疗的敏感性[35]。一项scRNA-seq研究TAM群体对放疗反应的变化,发现小胶质细胞的比例增加,导致免疫抑制表型[34]。

5 总结

scRNA-seq在分型方面具有更高的精准度,同一肿瘤中可同时存在多种不同状态的肿瘤细胞,这些肿瘤细胞具有不同的遗传背景、免疫微环境和侵袭能力,具有一定的进化方向。scRNA-seq可在分子水平上对GBM微环境中各类细胞进行检测,其中TAMs在GBM中不仅发挥着重要的免疫抑制功能还与肿瘤细胞的MES状态密切相关,不同亚型的肿瘤中以及同一肿瘤的核心与周边分布着功能不同的TAMs。在治疗方面,近年来scRNA-seq针对抗PD-1治疗效果不佳做出了许多研究,结合靶向巨噬细胞的治疗有可能增加T细胞的抗肿瘤效果。scRNA-seq还可以研究肿瘤的耐药问题,为解决肿瘤各种治疗的耐药问题提出新思路。但是目前scRNA-seq依旧有许多局限性,如:①需要细胞分离、清除细胞碎片和死亡细胞,以获得活的、单个的新鲜细胞,这可能会改变其转录组,且遗传物质过低的细胞容易被遗漏。②这些数据只从单个细胞中恢复了几千个独特的转录本,远低于整个转录组谱。③丢失了关键的空间信息,不利于理解细胞功能和病理变化。④需要用质量控制、批次矫正、样本归一化等研究方法降低scRNA-seq数据技术的噪声和生物变异,最小化RNA损失和保持信息的保真度是scRNA-seq技术中的一个关键挑战。越来越多的工具被专门提出用于分析scRNA-seq数据,每种方法都有自己的优缺点,因此为了有效地处理scRNA-seq数据的高变异性,应注意选择适当的分析方法[6]。总之,scRNA-seq技术的不断创新和伴随而来的生物信息学方法的进步,极大地促进了生物学和临床医学的研究。