非编码RNA调控结核分枝杆菌感染巨噬细胞自噬的研究进展*

彭祥琳, 浦飞飞, 冯 晶△, 夏 平

1华中科技大学同济医学院附属武汉市中西医结合医院骨科,武汉 430022 2武汉市第四医院骨科,武汉 430033

结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的慢性传染病。MTB主要寄生于巨噬细胞内,当MTB侵入宿主后,巨噬细胞可以通过多种模式识别受体识别病原相关分子模式,启动细胞自噬、细胞凋亡、产生自由基、分泌炎症因子等“灭杀”MTB[1]。细胞自噬是一种广泛存在于人体细胞的生理过程,可直接“灭杀”巨噬细胞中的MTB,而MTB又可以通过复杂的机制逃避细胞自噬对其“灭杀”,从而在宿主细胞内长期存活[2]。多数MTB感染者处于MTB携带状态,并不会表现出临床症状,部分未接受规范化抗结核治疗的患者也会转为非活动型TB和耐药型TB。据世界卫生组织报道,2020年全球MTB潜伏性感染人群接近20亿,这些潜伏性感染的MTB可以在机体免疫力下降时复苏繁殖,最终引发活动性肺结核[3]。有研究提出自噬激活剂作为标准抗结核药物的补充治疗以及耐药型结核的代替治疗是一个很有潜力的治疗方案[4]。近年来,随着高通量筛选技术的广泛应用,大量差异性表达的非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)及其靶基因被鉴定出来,多种ncRNAs调控MTB感染巨噬细胞自噬的分子通路也被验证。因此,本文综述了细胞自噬的发生过程与ncRNA的调控功能,讨论了现阶段研究中ncRNA调控MTB感染巨噬细胞自噬相关的机制,以期为阐明TB的发病机制以及研发抗结核药物提供新的思路。

1 细胞自噬

细胞自噬又称为Ⅱ型程序性细胞死亡,在提供细胞内能量来源、维持细胞内稳态和清除无用细胞等方面发挥重要作用,也是一种针对病原体的先天免疫防御机制。巨噬细胞是MTB感染的靶细胞,可以表达多种模式识别受体识别MTB释放的糖脂类、糖蛋白和碳水化合物等病原体相关分子模式,如Toll样受体、NOD样受体和C型凝集受体等[5]。经典的自噬根据细胞内底物运输到溶酶体的方式分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[6]。本文所讨论的自噬为巨自噬,即细胞质中可溶性大分子物质以及变性的细胞器被内质网、线粒体来源的单层或双层膜延伸包裹形成自噬体。随后自噬体的外膜与溶酶体膜融合形成自噬溶酶体,自噬体内的待降解物暴露于溶酶体水解酶,最终自噬体与内部的待降解物一起被降解,降解产物被释放回细胞质供细胞使用。自噬发生过程主要包括前自噬体的形成、自噬体延伸、自噬溶酶体成熟、被包裹内容物的降解与再利用[7]。该过程涉及的自噬相关基因在酵母菌以及人和小鼠同源基因中有不同的命名方式,本文主要以酵母菌自噬相关基因(autophagy related gene,ATG)命名方式及其对应的蛋白即ATG蛋白进行讨论。

1.1 前自噬体的形成

正常生理状态下,细胞保持着低水平的自噬,自噬水平依赖雷帕霉素靶蛋白复合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1,mTORC1)的调控。mTORC1是细胞分解与合成代谢的中心,活化的mTORC1可以抑制自噬进而抑制细胞分解代谢,当细胞在饥饿或应激状态下时,mTORC1的活性被抑制,导致ATG13去磷酸化并与ATG1、ATG17形成ATG13-ATG1-ATG17复合物进一步启动下游的自噬体形成与延伸[8]。mTORC1受到多个通路的调控,主要有AMPK-mTORC1通路、PI3K/Akt/mTORC1通路和Ras/Raf/MEK/ERK通路[9]。前自噬体的成核过程和PI3K-Beclin-1复合物密切相关,该复合物作用于膜泡的成核阶段,介导前自噬体结构的形成,这对于自噬体膜的延伸以及招募其他自噬相关蛋白非常重要[6]。PI3K-Beclin-1复合物可以招募ATG12-ATG5和ATG16以及LC3促进吞噬体的延伸[7]。实验表明,多种调节蛋白可以与内质网与吞噬体上的PI3K和Beclin-1结合调控自噬,如UVRAG、BIF-1、Atg14和Ambra可以促进自噬,Rubicon和Blc-2可以抑制自噬[10],其中UVRAG为miRNA-125a-3p调控自噬的靶点[11]。

1.2 自噬体延伸

自噬体的延伸主要依赖于ATG12的结合过程和LC3的修饰过程,这是两种类泛素化的系统,需要泛素活化酶E1与E2的参与。ATG12首先被E1样酶ATG7活化,再由E2样酶ATG10转运并与ATG5结合,然后和ATG16结合形成ATG12-ATG5-ATG16复合体,这个复合体定位在前自噬体的外膜表面参与自噬体膜的延伸[7]。LC3的修饰过程同样依赖泛素化修饰过程,LC3前体被ATG4加工为可溶于胞质的LC3-Ⅰ,然后在E1样酶ATG7和E2样酶ATG3的作用下,和磷脂酰乙醇胺(PE)共价连接形成脂溶性的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ可以与新形成的自噬体膜结合,并定位于自噬体内膜和外膜直到与溶酶体融合形成自噬溶酶体,因此,LC3-Ⅱ也是检测自噬形成的标志蛋白[6,10]。

1.3 自噬体的成熟及裂解

自噬体的成熟主要是指双膜自噬体完成延伸并关闭后与溶酶体融合进而降解其内容物。自噬体与溶酶体首先要相互靠近,然后在SNARE复合体的介导下互相融合。在哺乳动物中,该复合体由STX17、SNAP29、VAMP7以及VAMP8组成[12]。此外,参与成熟阶段的相关蛋白还包括:LAMP1、LAMP2、UVRAG[10,13]。自噬溶酶体的裂解是指自噬溶酶体膜的裂解及内容物在溶酶体水解酶的作用下降解的过程,降解内容物的目的不是单纯地消除内容物,而是作为一种动态的循环系统提供细胞更新和代谢所需要的能量与物质。降解过程中产生的氨基酸及部分蛋白可以为细胞提供营养、能量或循环利用。在降解过程中也有多种自噬蛋白参与,如ATG22直接参与部分氨基酸的转运,ATG12与ATG15参与自噬溶酶体的裂解,ATG1和ATG13参与溶酶体水解酶的转运等[10,14]。

2 非编码RNA调控结核分枝杆菌感染的自噬

人类基因组中绝大多数转录本都不编码蛋白质,起初这些ncRNAs被视为蛋白质转录的“噪音”,但近些年的研究发现,这些ncRNAs参与了从表观遗传到mRNA转录后调控等不同水平的基因调控。根据核苷酸链的长度,ncRNAs主要被分为微小RNA(microRNAs,miRNAs)、长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)、环状RNA(circular RNAs,circRNAs)等。miRNA是长度为19～25个核苷酸的小RNA,可以靶向结合mRNA的3′UTR互补序列,直接在蛋白质水平上调控基因的表达[4,15]。lncRNAs是长度大于200个核苷酸的转录本,它可以从蛋白质编码基因的任何部分调控转录,相比于miRNAs,lncRNAs功能更为多样复杂。研究表明,lncRNAs可以结合蛋白质复合物、转录因子调控基因表达,也可以互补结合反义lncRNA或作为miRNA的“海绵”调控mRNA表达[16-17]。circRNAs是一种单链环状RNA分子,其5′和3′端共价连接成为环状分子,可以与特定的蛋白结合或者作为miRNA的“海绵”靶向抑制miRNA[18-19]。早期对于ncRNA的研究主要集中在肿瘤和病毒感染等领域。然而近年来随着对ncRNAs的研究逐渐深入,许多研究发现ncRNAs在TB的早期诊断、调控MTB感染导致的细胞自噬、细胞凋亡等途径中具有重要作用[20]。

单个ncRNA可以调控多种自噬蛋白进而调控自噬的多个发生过程,例如miR-33和miR-33*通过下调ATG5、ATG12、LAMP1、LC3-Ⅱ等多个自噬基因调控自噬[21],一个自噬基因也受到多种ncRNAs的调控。miR-155可以靶向E2样泛素活化酶ATG3的表达进而抑制自噬[22],也可以靶向细胞凋亡相关基因FOXO3调控细胞凋亡[23-24]。完善这种复杂的调控网络,对于进一步发现MTB免疫逃逸的机制以及抗结核药物的开发具有重要意义。

2.1 ncRNAs在自噬体形成阶段调控自噬

在自噬体形成的起始阶段,mTORC1活性降低进而启动自噬,形成ATG13-ATG1-ATG17复合物诱导下游的自噬体成核与延伸[9]。研究发现,在活动性结核病患者和H37Rv感染的小鼠巨噬细胞中,miR-27a的表达上调,靶向下调内质网上的Ca2+转运体CACNA2D3,进而抑制自噬体的形成[25]。钙离子的降低可以通过Ca2+/CaMKKβ/AMPK/ATG1通路抑制自噬[8]。Jiang等[26]还发现,在卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)感染的THP-1细胞中,LncRNA MIAT的表达上调,而miR-665的表达呈时间依赖性下调。该研究证明了LncRNA MIAT作为miR-655的“海绵”减弱后者对AGT1的抑制,揭示了MIAT-miR-655-ATG1信号通路。

在PI3K与Beclin-1介导的自噬体成核阶段也受到多个ncRNAs的调控,Chen等[27]发现在H37Rv感染的THP-1细胞中miR-30A表达上调,并且miR-30A通过选择性下调Beclin-1和ATG5的表达抑制细胞自噬,进而促进MTB在体内存活。肺结核涂片阳性患者肺泡巨噬细胞的miR-30A浓度高于涂片阴性患者,经过抗结核治疗后的涂片阳性患者miR-30A水平显著降低。多种调节蛋白与Beclin-1结合也可以调控自噬,上文提到的miRNA-125a-3p在H37Rv感染的小鼠巨噬细胞中表达上调,并靶向抗紫外线相关基因UVRAG,从而抑制自噬的激活和巨噬细胞对MTB的抗菌作用[11]。Kumar等[28]发现在H37Rv感染小鼠巨噬细胞期间,miR-17-5p的表达下调,并靶向Mcl-1和STAT3并增强自噬,Mcl-1是抗凋亡蛋白Bcl-2家族中的一员,其与Beclin-1结合可以抑制自噬[29]。

2.2 ncRNAs在自噬体延伸阶段调控自噬

自噬体的延伸阶段主要依赖的两个类泛素化系统,如E1样酶ATG7、E2样酶ATG10和ATG3,以及ATG12-ATG5-ATG16复合体、LC3、ATG4等都是ncRNAs调控的靶点。Ouimet等[21]发现,在H37Rv感染的小鼠巨噬细胞感染期间可以诱导miR-33表达上调,而miR-33可以下调自噬相关基因ATG5、ATG12、LAMP1和LC3-Ⅱ表达,进而抑制巨噬细胞自噬。而miR-33缺乏的小鼠具有更强的巨噬细胞自噬和抗MTB的能力。重要的是,该研究还发现MTB诱导的miR-33表达上调会减少自噬介导的脂滴向溶酶体的输送和损害线粒体脂肪酸氧化,从而促进巨噬细胞脂质储存,这些脂质会在慢性感染期作为营养源输入到MTB中,这个现象在miR-33基因敲除的小鼠中观察到相反的表现。脂质丰富的环境促使MTB逃避先天免疫防御,并为其复制提供丰富的营养,富含脂质的MTB具有休眠杆菌的特性,包括对抗结核药物的耐药性等,这表明miR-33可能在非活动性TB和耐药性TB中发挥重要作用[30-31]。Shi等[32]发现,在MTB感染的人类肺泡巨噬细胞中,circAGFG1表达水平升高,靶向下调miR-1275,而沉默miR-1275后可以增加细胞内LC3、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的水平,进而促进自噬。而该研究进一步验证了miR-1275的靶点,发现miR-1275通过靶向Notch2来调控细胞自噬和凋亡,揭示了circAGFG1-miR1257-Notch2信号轴对自噬的调节作用。

部分ncRNAs以泛素样酶为靶点调控自噬,例如miR-129-3p靶向ATG4抑制自噬[33]。Qu等[34]也发现H37Ra感染的小鼠巨噬细胞中miR-142-3p下调,并证明了miR-142-3p可以通过靶向ATG16和ATG4阻断吞噬体的成熟。在H37Ra感染的THP-1巨噬细胞中miR-106a下调,miR-106a可以通过靶向ATG1、ATG7和ATG16抑制自噬。在MTB感染过程中强制表达miR-106a可以提高MTB存活率,而抑制miR-106a表达则可以降低MTB在细胞内的存活率,该研究为结核病的诊治提供了一个潜在的靶点[35]。在H37Rv感染的人原代树突状细胞中miR-155表达上调,而在BCG和热灭活的感染模型中miR-155表达的效果并不明显,这表明miR-155的表达调控需要有毒性的活细菌刺激,该研究发现miR-155通过靶向抑制ATG3的表达进而抑制自噬[22]。另一项研究发现,在活动性TB患者的巨噬细胞中lncRNA PCED1B-AS1表达下调,并证明了PCED1B-AS1作为miR-155的“海绵”阻断miR-155表达进而调控自噬,在体外模型中敲除PCED1B-AS1基因后细胞凋亡被抑制,自噬被促进。有趣的是,该研究还发现PCED1B-AS1的抑制可以明显减弱肿瘤坏死因子-α诱导的凋亡[36],在我们之前的研究中发现在骨关节结核患者中,自噬水平增加,肿瘤坏死因子-α的表达增加,破骨细胞的凋亡受到抑制,调控PCED1B-AS1维持骨关节结核患者骨平衡可能是一个潜在的靶点[37]。

2.3 ncRNAs在自噬体成熟和裂解阶段调控自噬

自噬体与溶酶体的融合主要依赖于SNARE复合物,然而目前研究对这一过程的精确调控所知甚少[12]。其他蛋白如UVRAG也参与了自噬体的成熟阶段,miRNA-125a-3p靶向UVRAG抑制自噬体的成熟[11]。也有研究发现MTB通过分泌蛋白质酪氨酸激酶A来抑制吞噬体酸化和成熟[38],以及调节巨噬细胞铁离子、氢离子浓度来影响自噬体和溶酶体的融合[39],其具体调控机制是否涉及ncRNAs调控仍需进一步研究。在自噬溶酶体裂解阶段,ATG12直接参与了裂解,miR-33可以靶向ATG12进而抑制自噬[21]。ATG1和ATG13参与了溶酶体水解酶的转运,miR-106a可以靶向ATG1抑制自噬[35]。

2.4 ncRNAs在巨噬细胞识别病原相关分子模式阶段调控自噬

ncRNAs还可以在巨噬细胞识别病原相关分子模式阶段调控自噬,Gu等[40]发现在MTB感染的小鼠巨噬细胞中miR-23a-5p表达上调并靶向TLR2蛋白,导致TLR2-MyD88-NF-κB信号通路的活性降低。TLR2是Toll样受体家族的一员,在TLR2识别MTB分泌的病原相关分子模式后可以招募MyD88并通过下游信号分子激活NF-κB信号途径,进而介导人单核细胞系的凋亡与自噬。同时MTB分泌的多种抑制性凋亡效应物可以被TLR2识别进而实现免疫逃逸,如结核菌酸、索状因子、海藻糖等。该研究揭示了MTB通过影响TLR2-MyD88-NF-κB信号通路实现免疫逃逸的另一重要机制[6,41]。此外巨噬细胞模式识别受体被激活后还可触发p38-MAPK、ROP1-ERK等通路,进而激活PI3K-Beclin-1复合物及其下游信号。Ke等[42]发现,活动性肺结核患者的单核细胞中lincRNA-EPS表达下调,并且单核细胞的自噬增强,凋亡减弱,该研究还证明了lincRNA-EPS下调可以通过激活JUN-MAPK信号通路抑制凋亡并增强自噬。在斑马鱼模型中发现了一种被称为DNA损伤调节自噬相关蛋白(DNA damage-regulated autophagy modulator protein,DRAM)的蛋白家族,该蛋白可以在TLR2-MyD88-NF-κB通路的下游发挥作用激活自噬[43]。在一项研究中发现hsa-miR-144-5p(miR-144*)在BCG、H37Rv和H37Ra感染的人外周血单核细胞中以时间或剂量依赖性的方式上调,miR-144*的过度表达可以靶向人类单核细胞和巨噬细胞中DRAM的3′UTR,从而抑制了吞噬体的形成。在肺结核和肺外结核患者的人类外周血单核细胞和组织中miR144*的水平升高,DRAM2的表达降低,这表明miR144*可能是一个潜在的诊断和治疗靶点[44]。另一项研究也发现,在BCG感染的小鼠巨噬细胞中,miR-125b-5p的表达上调,并且其同样可以靶向DRAM2进而抑制BCG感染的巨噬细胞自噬[45]。Chen等[46]发现在潜伏性结核患者中,miR-899的表达上调,miR-899可以通过靶向抑制TWEAK的途径抑制自噬以维持MTB的潜伏状态,TWEAK可以通过激活AMPK诱导自噬。重要的是,该研究还发现了TNF-α可以诱导miR-899的升高,并且在使用TNF-α抑制剂阿达木单抗治疗后,潜伏性结核的患者miR-899降低,TWEAK升高并出现肉芽肿的破坏以及潜伏性TB的再激活,这表明miRNAs在潜伏性结核中也具有重要作用,同时也是诊断潜伏性TB以及再激活的生物标志物。

3 小结与展望

现阶段ncRNAs调控自噬的研究证明了ncRNAs在MTB感染巨噬细胞自噬发生过程的多个阶段参与了调控,其机制组成了一个复杂的信号交互网络(图1)。而MTB与巨噬细胞的相互作用十分复杂,涉及到细胞自噬、凋亡等免疫防御机制,还涉及到凋亡与自噬的相互调控。MTB也可以通过多种途径实现免疫逃逸,本文综述的ncRNAs调控机制是MTB免疫逃逸机制的一部分(表1)。然而目前的研究还远远不够,仍有许多问题没有解决,例如部分ncRNAs表达水平在MTB感染细胞中仅比对照组高一倍,这部分ncRNAs是否起主要调控作用仍需进一步阐明。在MTB感染中自噬体成熟阶段所涉及ncRNAs的调控研究较少,目前已发现的调控机制中是否有ncRNAs的参与也需要进一步证明。总之,更多ncRNAs调控MTB感染巨噬细胞自噬的研究值得期待,这对于进一步阐述MTB免疫逃逸机制和开发新型的抗结核药物以及TB的早期诊断具有重要价值。

表1 参与调控MTB感染后巨噬细胞自噬的ncRNAs及其功能Table 1 ncRNAs and its function involved in regulating autophagy of MTB-infected macrophages

图1 MTB感染中ncRNAs调控巨噬细胞自噬机制示意图Fig.1 ncRNAs regulate macrophage autophagy in MTB infection