低蛋白与酮酸饮食干预对糖尿病肾病小鼠肾脏功能的影响

吴宇 谢祥成 赵宁 杨秀

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病微血管病变的常见慢性并发症之一，以肾小球基底膜增厚、通透性增加，系膜细胞增殖及细胞外基质增多为主要病理改变，表现为持续性白蛋白尿[1]。除了合理药物治疗积极控制血糖之外，饮食治疗是糖尿病治疗的重点，同时也是DN 患者治疗的基础[2]。低蛋白饮食是指在满足机体营养的情况下，降低机体蛋白摄入量的一种膳食方式，其目的是减少体内代谢废物，减轻肾脏代谢负荷[3]。研究显示，低蛋白结合酮酸饮食可有效降低DN 患者24 h 尿白蛋白排泄率，抑制机体氧化应激水平，对延缓肾功能损伤起到一定作用[4-5]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)参与肾小球硬化及肾小管间质纤维化，TGF-β1 的激活与DN 发展有关[6]。基于此，本研究探讨低蛋白补充酮酸对DN 小鼠肾脏功能的改善作用和对肾组织TGF-β1 含量影响，分析完善低蛋白饮食方式延缓DN进展的作用机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级db/db 小鼠（2 型糖尿病肾病模型小鼠）18只、db/m 小鼠（db/db 小鼠的对照）6 只（7 周龄，均为雄性），购自江苏集萃药康生物科技有限公司[动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008], 饲养于浙江鹰旸医药研发有限公司屏障系统[许可证号：SYXK（浙）2021-0003]。系统环境为恒温（22±2）℃、恒湿（50%～60%），通风，12 h 明暗交替光照。本研究经浙江鹰旸医药研发有限公司实验动物伦理委员会审查通过（批准文号：ZJEY-20230619-01）。

1.1.2 主要试剂和仪器 正常蛋白饲料、低蛋白饲料、低蛋白-酮酸饲料均购自天津科澳协力饲料有限公司。Ⅳ型胶原（ⅣCollagen，Ⅳ-Col）、TGF-β1 抗体购自美国affinity 抗体公司（批号：82A6748、20r6523）。E100 显微镜购自日本尼康公司；KF-PRO-120 全景扫描仪购自宁波江丰生物信息技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与饮食干预 18 只db/db 小鼠适应性饲养1 周后尾静脉采血测定空腹6 h 血糖，平均血糖值≥16.7 mmol/L，采用随机数字表法分为正常蛋白饮食组、低蛋白饮食组、低蛋白-酮酸饮食组，每组各6 只，分别给予正常蛋白饮食（添加24%酪蛋白）、低蛋白饮食（添加6%酪蛋白）、低蛋白-酮酸饮食。6 只db/m 小鼠设为正常对照组，给予正常蛋白饮食。各组小鼠以对应饲养方式连续喂养12 周，结束后进行后续相应指标检测。

1.2.2 指标检测

1.2.2.1 基本指标检测 自喂养开始至结束，每隔2 周测定各组小鼠体重。喂养结束后，小鼠当天禁食过夜，第2 天记录小鼠的24 h 饮水量及排尿量。

1.2.2.2 生化指标检测 记录小鼠24 h 饮水量及排尿量后，立即通过眼眶静脉丛取血。血糖仪检测血糖；分离血清，采用全自动生化分析仪检测血肌酐、尿素氮、TG 和TC。

1.2.2.3 肾脏体积、肾重/体重比值检测 小鼠取血后，立即二氧化碳安乐死，称体重。取小鼠双侧肾脏，测量肾脏横径以大体反映肾脏体积，并拍照记录，称重量，计算肾重/体重比值。保留肾脏组织用于后续检测。

1.2.2.4 肾脏组织病理变化检测 制备肾脏组织石蜡切片，常规脱蜡至水。HE 染色，镜下观察肾脏组织病理变化。同时行过碘酸雪夫染色（periodic acid-Schiff stain，PAS）：烤箱（62 ℃）烘烤切片1 h，脱蜡、水化、清洗；0.5%过碘酸水溶液孵育氧化5 min，蒸馏水彻底清洗；雪夫染色试剂孵育20 min，清洗；哈瑞苏木素染细胞核1 ～2 min，流水清洗；乙醇脱水后透明，封片，镜下观察系膜基质、基底膜增生和糖原聚集情况（染色红紫色为阳性）。

1.2.2.5 肾脏组织TGF-β1 和Ⅳ-Col 表达水平检测采用免疫组化染色法，肾脏组织切片烘烤、脱蜡、水化，过氧化氢阻断溶液阻断内源性过氧化物酶，PBS 清洗。抗原修复，PBS 清洗甩干，封闭液封闭20 min。稀释（1∶100）的TGF-β1、Ⅳ-Col 一抗抗原，4 ℃过夜孵育。隔天取出，常温放置1 h，清洗。随后孵育二抗30 min，清洗。显色试剂孵育反应，根据显色程度终止反应，清洗后，苏木素复染细胞核，清洗，脱水。透明标本，封片，显微镜下观察阳性表达情况（染色黄色至棕黄色为阳性）。用Image J 软件定量分析免疫组化图，通过AOD 值作统计图。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组小鼠基本指标比较 与正常对照组比较，正常蛋白饮食组小鼠喂养第2、4、6、8、10、12 周的体重均增加（均P＜0.05）；24 h 饮水量和排尿量均增加（均P＜0.05）。与正常蛋白饮食组比较，低蛋白饮食组和低蛋白-酮酸饮食组小鼠第2、4、6、8、10、12 周体重均减轻（均P＜0.05）；24 h 饮水量和排尿量均减少（均P＜0.05）。见表1、表2。

表1 4 组小鼠体重比较（g）

表2 4 组小鼠24 h 饮水量和排尿量比较（mL）

2.2 4 组小鼠生化指标变化 4 组小鼠血糖、血肌酐、血尿素氮、TG、TC 水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与正常对照组比较，正常蛋白饮食组小鼠血糖、血肌酐、尿素氮、TG、TC 水平均升高（均P＜0.05）。与正常蛋白饮食组比较，低蛋白饮食组和低蛋白-酮酸饮食组小鼠血糖、血肌酐、尿素氮、TG、TC 水平均降低（均P＜0.05）。见表3。

表3 4 组小鼠生化指标改变

2.3 4 组小鼠肾脏体积、肾重/体重比值比较 与正常对照组相比，正常蛋白饮食组小鼠肾脏体积增大，且肾脏周围出现较多脂肪，小鼠肾重/体重比值上升（P＜0.01）；与正常蛋白饮食组小鼠比较，低蛋白饮食组和低蛋白-酮酸饮食组小鼠周围的脂肪明显减少，肾脏体积缩小，小鼠肾重/体重比值显著下降（均P＜0.05）。见图1（插页）、表4。

表4 4 组小鼠肾重/体重比值比较（mg/g）

图1 4 组小鼠肾脏体积肉眼观察比较

2.4 4 组小鼠肾脏组织病理变化比较 正常对照组小鼠肾脏组织形态正常，肾小球系膜无增生，组织内未见明显炎性细胞浸润或结缔组织增生；正常蛋白饮食组小鼠肾小球形状不规则，系膜基质增生，并出现炎性细胞浸润。与正常蛋白饮食组小鼠比较，低蛋白饮食组和低蛋白-酮酸饮食组小鼠肾小球系膜增生有所改善。见图2（插页）。

图2 4 组小鼠肾脏组织病理变化镜下所见

2.5 4 组小鼠肾脏组织TGF-β1 和Ⅳ-Col 水平比较4 组小鼠肾脏组织TGF-β1 和Ⅳ-Col 水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与正常对照组比较，正常蛋白饮食组小鼠肾组织TGF-β1、Ⅳ-Col 水平均升高（均P＜0.05）。与正常蛋白饮食组比较，低蛋白饮食组和低蛋白-酮酸饮食组小鼠肾组织TGF-β1、Ⅳ-Col 水平均降低（均P＜0.05）。见图3（插页）、图4。

图4 4 组小鼠肾脏组织TGF-β1 和Ⅳ-Col 水平比较

3 讨论

蛋白质摄入可促进肾小球血管扩张，促进胰高血糖素分泌，升高机体血糖水平，因此对于早期DN 患者，限制膳食中蛋白质含量可减轻肾脏负担，并控制机体血糖水平[7]。通过既往DN 动物模型可了解到，低蛋白饮食或联合酮酸可减轻DN 鼠肾脏肥大，减轻肾小球系膜基质积聚以及肾小球基底膜增厚等肾脏病理改变，改善血糖、血脂等生化指标[8-9]。本研究中，自发性2 型糖尿病动物模型db/db 小鼠分别用正常蛋白饲料、低蛋白饲料、低蛋白-酮酸饲料喂养12 周后，在低蛋白喂养的方式下，db/db 小鼠体重下降，饮水量、排尿量增加，血糖水平下降，血脂TG、TC 指标含量下降，肾脏体积缩小，肾周围脂肪组织减少，其中联合酮酸可加强对各项指标的控制，表明低蛋白或联合酮酸可改善db/db 组小鼠基本指标以及DN 相关生化指标，减轻DN 小鼠肾脏肥大。

TGF-β1 是目前较为明确的肾脏纤维化诱导因子，通过诱导肾小管上皮细胞间质转化和胶原合成，参与DN 进展[10-11]。张世鲁等[12]研究表明，抑制DN 大鼠肾脏组织TGF-β1 表达，可改善大鼠肾脏组织纤维化程度。Ⅳ-Col 是肾小球细胞外基质的主要胶原组成成分，在DN 早期合成增加[13]。唐诗等[14]研究表明，高糖诱导可促进小鼠系膜细胞TGF-β1 基因表达，和细胞上清液Ⅳ-Col 含量。本研究染色结果显示，正常蛋白饮食组小鼠肾小球形状改变，基底膜增厚，组织TGF-β1、Ⅳ-Col 水平较正常对照组小鼠显著升高，而低蛋白或联合酮酸饲养可显著降低db/db 小鼠肾组织TGF-β1、Ⅳ-Col 水平，减少系膜基质增生，提示低蛋白或联合酮酸饮食可能通过降低肾脏组织TGF-β1、Ⅳ-Col 水平而减少DN 小鼠肾脏系膜基质增生。

综上所述，低蛋白和酮酸补充的饮食方式可改善DN 小鼠生化指标，降低肾脏组织TGF-β1、Ⅳ-Col 表达水平，改善肾组织损伤形态，具有延缓DN 肾损伤的作用。