黄连素在抑制幽门螺杆菌多重耐药中的作用研究

周帆 彭君伟 徐小青 曹勤

幽门螺杆菌（helicobater pylori，Hp）是一种主要定植于人体胃黏膜的微需氧菌。Hp 感染是我国最常见的慢性感染性疾病，人群中的感染率约为50%[1]。现代医学研究表明Hp 通过产生空泡毒素等引起细胞损伤，促进相关炎症介质的表达引起胃黏膜慢性炎症[2]，从而诱发多种消化道疾病，同时也是胃癌、胃黏膜相关组织淋巴瘤发生、发展的重要危险因素[3]。因此根除Hp 对于预防和治疗此类疾病至关重要。自从含铋剂的四联方案被推荐为抗Hp 治疗的一线方案以来[4]，Hp 的根除率得到了提高。然而近年来Hp 对常用抗菌药物克拉霉素（clarithromycin，CLR）、甲硝唑（metronidazole，MTZ）、左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）的耐药率持续超过警戒水平，更有报道称我国2018 至2020 年抗菌药物的多重耐药（multi-drμg resistant，MDR）率已高达26.5%[5]，四联方案的疗效受到严重影响。如何逆转Hp 耐药、提高Hp 的根除率成为当前临床急需解决的难题。近年来越来越多的临床工作者把目光投向了中医药，研究表明许多中药成分有天然的抗菌活性，在治疗方案中加入中药可以提高Hp 根除率，有效改善临床症状，减少西药的不良反应[6]。文献研究发现抗Hp 的单味中药以清热解毒类为主，其中黄连的体外抑菌效果明显强于其他单药，且为抗Hp 的中药复方中的核心药物[7]。而黄连的抗Hp 作用主要与其活性成分黄连素有关[8]。黄连素不仅有很强的体外抑菌作用，而且能抑制致病菌对抗菌药物的耐药性[9]。有研究发现CLR 耐药Hp 菌株经黄连素作用后，其耐药性可发生逆转[10]，但黄连素对Hp 的MDR 株是否有相似作用国内外相关研究不多。故本研究通过体外诱导培养MDR 株来观察黄连素抑制Hp 的MDR 株对常用抗菌药物耐药性的作用，以期为黄连素用于临床抗Hp 治疗提供实验依据，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验菌株 本实验分离的Hp 临床菌株均来自上海市普陀区中心医院内镜室2017 年9 月至2018 年10月期间行胃镜检查且组织活检经尿素酶试验检测为阳性的患者，在中心实验室通过体外分离培养获得，并同时经3 种方法（形态学、过氧化氢试验、革兰染色）鉴定为Hp 菌落。质控菌株ATCC 43504 购自上海普盛生物科技有限公司。

1.2 主要试剂和仪器 98%黄连素原药（粉剂，规格：1 g/瓶，批号：SLBB2771V）购自美国Sigma 生物公司，意大利Liofilchem E-test 试纸条（规格：10 条/包，批号：120326）购自上海枫岳生物科技有限公司，英国OXOID 脑心浸液粉（规格：500 g/瓶，批号：2309228）、哥伦比亚琼脂粉（规格：500 g/瓶，批号：2160231）均购自上海典森生物科技有限公司，美国Gibco 无菌FBS（规格：500 mL/瓶，批号：42Q8275K）购自上海睿安生物科技有限公司，无菌脱纤维绵羊血（规格：100 mL/瓶，上海顺威生物技术有限公司），A400 型27 位多点接种仪（上海典森生物科技有限公司，型号A400-027S），三气培养箱（赛默飞世尔科技有限公司，型号:HERAcell vios160i）。

1.3 方法

1.3.1 检测分离株的耐药性 采用E-test 法分别检测分离株对4 种抗菌药物的耐药性，将生长良好的细菌收集在无菌0.9%氯化钠溶液中，吹打均匀；用麦氏比浊管调整浓度为2.0 麦氏比浊度（相当于菌液浓度2.0×108CFU/mL）；吸取100 μL 菌液至培养基上，用接种环涂布均匀并完全晾干；将抗菌药物E-test 试纸条轻放至平板表面，在三气培养箱中培养3 d 后观察细菌生长情况，抑菌环与试纸条相交处的读数即为该抗菌药物对菌株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。药敏实验均以标准菌株ATCC 43504 作为质控菌株。按照美国临床实验室标准委员会的耐药标准筛选耐药/敏感菌：MIC≥1 μg/mL 为阿莫西林（amoxicillin，AMX）耐药，MIC＞2 μg/mL 为LEV 耐药，MIC≥2 μg/mL 为CLR 耐药，MIC≥8 μg/mL 为MTZ耐药。从中筛选出双重耐药（double-drμg resistant，DR）株和MDR 株，并计算各抗菌药物的耐药率、分离株中的DR 率、MDR 率。

1.3.2 DR 株体外诱导耐药 采用抗菌药物浓度递增法对DR 株进行体外诱导培养，以1/2 MIC 作为初始诱导的药物浓度，将DR 株依次接种在抗菌药物浓度呈两倍递增的琼脂平板上培养，重复操作直到DR 株停止生长或抗菌药物终浓度高于最低耐药浓度后停止诱导。将得到的耐药株在无抗菌药物平板上培养3 代后，用E-test 法测定其MIC 值，若达到耐药标准为体外诱导MDR 株成功。

1.3.3 测定黄连素对MDR 株的MIC 值 采用倍比稀释法制备黄连素浓度范围为4～256 μg/mL 的倍比稀释平板，将MDR 菌株制成2.0 比浊度的菌液，用27 孔细菌多点接种仪将菌液分别接种于黄连素琼脂平板上，同时以ATCC 43504 作为质控标准菌，以不含黄连素的培养基作为空白对照，微需氧培养3 d 后观察细菌生长情况，记录黄连素对菌株的MIC 值。

1.3.4 测定黄连素对MDR 株耐药性的影响 从分离MDR 株和诱导MDR 株中选取27 株高水平耐药株，以含1/2 MIC 黄连素的液体培养基（含10%的FBS）培养MDR 菌株，先将MDR 菌株在液体培养基中复苏后，对照组正常传代，实验组另外加入终浓度为1/2 MIC 的黄连素原液，对照组加入相同体积的双蒸水，放入三气培养箱（37 ℃、5%O2、10%CO2条件下）中培养，同时以150 r/min（离心半径0.125 mm）的速度摇菌，每36 h传代1 次。分别传至第1 代和第5 代时，通过E-test 法测定其耐药抗菌药物的MIC 值，以黄连素作用后MIC值较对照组下降≥4 倍或变为敏感株为阳性标准。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0 统计软件。非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组比较采用Kruskal-WallisH检验，组间两两比较采用Wilcoxon 秩和检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床分离株的耐药性 从128 株分离株中筛选出敏感株25 株、单一耐药株61 株、DR 株30 株、MDR 株12 株，AMX、LEV、CLR、MTZ 的耐药率分别为4.7%、26.6%、32.0%、64.8%，分离株中的总耐药率、DR 率、MDR 率分别为80.5%、23.4%、9.4%。

2.2 MDR 株体外诱导结果 DR 株通过体外诱导耐药共成功诱导出24 株MDR 株，AMX 诱导失败，均为LEV、CLR、MTZ 诱导耐药菌株，见表1。

表1 诱导耐药株诱导前后的MIC 值变化对照表（μg/mL）

2.3 MDR 株对黄连素的耐药性 黄连素对标准株ATCC 43504 的MIC 值为32 μg/mL，对MDR 株的MIC 值为8～128 μg/mL 水平，黄连素对MDR 株的MIC 值主要分布在32 μg/mL。

2.4 黄连素对MDR 株耐药性的影响 27 株高水平耐药株经黄连素处理后，共有17 株的MIC 值有阳性变化，其中包括CLR 阳性株9 株、LEV 阳性株11 株、MTZ阳性株5 株，见表2～4。比较3 种抗菌药物阳性株的MIC 值下降幅度，MTZ 组下降幅度最大，CLR 组居中，LEV 组最低，3 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；两两比较除CLR 组与MTZ 组比较差异无统计学意义（P＞0.05）外，另外两组间比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表5。

表2 MDR 株经黄连素作用前后克拉霉素的MIC 值变化（μg/mL）

表3 MDR 株经黄连素作用前后左氧氟沙星的MIC 值变化（μg/mL）

表4 MDR 株经黄连素作用前后甲硝唑的MIC 值变化（μg/mL）

表5 3 组抗菌药物阳性株的MIC 值下降倍数比较情况

3 讨论

随着临床抗Hp 治疗逐渐受到重视，抗菌药物的不规范使用导致其耐药率逐年升高。2014 至2015 年的一项Hp 耐药率调查数据显示：上海地区AMX、CLR、MTZ 和LEV 的耐药率分别为0、19.8%、57.0% 和29.1%，Hp 的耐药率、DR 率、MDR 率分别为68.6%、23.3%、7.0%[11]。本实验的结果与之相比整体呈明显上升趋势，抗菌药物耐药形势依旧严峻。具体来看：（1）AMX 的耐药率虽有所增长，但处于较低水平，仍可作为抗Hp 方案的首选药物；（2）Hp 的MDR 率有所升高，对于多次根除失败的患者需考虑到MDR 的可能，应根据药敏试验选择敏感抗菌药物以提高疗效[12]。

鉴于从临床分离株中筛选的MDR 株数量有限，本研究对筛选出的DR 株进行了体外诱导耐药。在诱导过程中发现：MTZ 诱导菌株的MIC 值均达到256 μg/mL以上，87.5% CLR 诱导菌株的MIC 值达到256 μg/mL 以上，66.7% LEV 诱导菌株的MIC 值达到32 μg/mL 以上，可见MTZ 诱导株的耐药水平最高，CLR 次之，LEV 最低。另一方面，AMX 诱导耐药成功率较低，诱导周期长，耐药程度不高，这与以往的研究报道相吻合[13]。与AMX 相比，其他3 种抗菌药物更易诱导成功。这提示临床上对于抗Hp 治疗失败的患者，反复使用LEV、MTZ 和CLR 易发生继发性耐药，而AMX 仍可重复使用[14]。抗菌药物的体外诱导耐药成功率可用来预测人群中抗菌药物的耐药趋势，为临床抗菌药物的选择提供参考依据[15-16]。

黄连素又名小檗碱，是从黄连等小檗属植物中提取的一种季铵类异喹啉生物碱，是黄连有效成分中主要的抑菌单体，历来广泛用于治疗急性胃肠炎、细菌性痢疾等感染性消化道疾病，近年来常与三联方案用于抗Hp 治疗。一项关于“含黄连素方案”抗Hp 感染疗效的Meta 分析报道，含黄连素方案的Hp 根除率和溃疡愈合率明显提高[17]。黄连素不仅临床应用安全有效，而且体外抑菌实验证明其抑菌作用很强。陈霞等[18]报道黄连素的MIC 值范围为4～32 μg/mL，而本实验得出的结果为8～128 μg/mL。两者存在差异可能是因为陈霞的实验株是随机分离株，而本实验所用菌株为MDR 株，且黄连素的MIC 值随着对其他抗菌药物的耐药性的增强而升高，导致本研究黄连素的MIC 值偏高。吴明慧等[19]测定黄连素对6 株MDR 株的MIC 值均为12.5 mg/mL，这可能与MDR 株的来源有关：不同地区的环境、抗菌药物使用情况不同，都会对Hp 菌株的耐药性产生很大影响。

关于黄连素对MDR 株耐药性的影响，刘三侠[20]报道黄连素能增强大肠杆菌MDR 株对环丙沙星的敏感性，其MIC 值降低了64 倍。本实验发现所有MDR 株与黄连素共同培养1 代后耐药性均无阳性变化，而培养5 代后MIC 值明显下降，部分菌株直接变为敏感株，这表明黄连素对部分MDR 株的耐药性具有逆转作用，且与作用时间密切相关。这一结论也在相关研究中得到了验证[21-22]。另一方面，黄连素的增敏作用与抗菌药物种类有关。在3 种抗菌药物中，MTZ 组的MIC值下降幅度最大，LEV 组最小，可见黄连素对MTZ 的耐药逆转作用最强，对LEV 的逆转作用最弱。

综上所述，黄连素能抑制MDR 株对多种常用抗菌药物的耐药性，且逆转作用较强，加之其本身具有抗菌活性，故黄连素在临床上可与其他抗菌药物联合用于抗Hp 治疗，具有良好的应用前景。黄连素虽然能逆转部分MDR 菌株的耐药性，但其机制尚不明确。有研究报道Hp 对MTZ 等抗菌药物的多重耐药与外排泵系统密切相关[23]，黄连素可通过抑制外排泵基因的表达逆转大肠杆菌MDR 菌株的耐药性[20]。而黄连素是否通过调控外排泵基因的表达来逆转Hp MDR 菌株的耐药性，可能成为未来的研究热点。