远华蟾毒精通过下调miR-181a抑制胃癌细胞生长及侵袭研究

于晓斌,张先辉

胃癌是常见的癌症之一[1]。研究表明,miRNA具有干预肿瘤发生发展的功能,可作为监测癌症的生物标志物[2-3]。研究证实,miRNA能够调控下游靶基因,从而在胃癌中发挥致癌或抑癌作用[4]。miR-181a是STAT3介导的TCRαβ+CD8+T淋巴细胞白血病生存网络中的新参与者[5]。miR-181a可作为治疗靶点和肿瘤标志物。靶向致癌miR-181a-2-3p可抑制胃癌的生长并降低顺铂耐药性[6]。远华蟾毒精是中国传统药物蟾酥的活性化合物,具有抗肿瘤作用。远华蟾毒精通过抑制JAK2/STAT3信号传导发挥抗肿瘤作用[7-8]。可见,远华蟾毒精可能通过干预miR-181a表达影响胃癌发生发展过程。本研究旨在分析远华蟾毒精通过下调miR-181a抑制胃癌细胞生长及侵袭,为胃癌的临床治疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2019年1月—2020年12月滨州医学院附属医院诊治胃癌患者90例,取其胃部病变标本及血液备用;另纳入30例癌旁组织样本备用。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及药物干预:本实验中使用的胃癌细胞系SGC-7901购自ATCC公司。细胞用含胎牛血清(10%)的DMEM培养基(Gibco,USA)在37 ℃、5% CO2、湿度95%的培养箱内进行培养。收集处于对数期胃癌细胞SGC-7901,制成4×104个/ml细胞悬液,100 μl接种于96孔细胞培养板中,置于37 ℃、5% CO2培养箱中过夜培养。设置对照组与远华蟾毒精组,每组3个复孔。远华蟾毒精组每孔加175 μl浓度分别为0.05、0.10、0.50、1.00、1.25 μg/ml的远华蟾毒精,对照组不加药。

1.2.2 RT-qPCR检测miR-181a表达水平:使用TRIzol提取总RNA。TaqMan MicroRNA反转录试剂盒(美国Life Technologies)将总RNA反转录为特定microRNA的cDNA。使用Taq Man MicroRNA检测试剂盒(美国应用生物系统公司)检测miR-181a表达水平。PCR扩增程序如下:在94 ℃下变性5 min,然后在94 ℃下变性30 s,在60 ℃下变性30 s,在72 ℃下变性40 s,共40个循环。以GAPDH为内参。miR-181a定量PCR引物序列号见表1。

表1 miR-181a和U6定量PCR引物序列号

1.2.3 MTT法检测细胞增殖情况:对数期胃癌细胞SGC-7901培养24 h后,每孔加入10 μl的噻唑蓝溶液,继续培养24 h。小心吸去培养液,每孔加入100 μl二甲基亚砜,置于摇床上低速震荡10 min。远华蟾毒精组和对照组分别于24 h和48 h各检测1次。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。

1.2.4 细胞凋亡检测:将对数期胃癌细胞SGC-7901接种在密度为5×105个细胞的6孔板中,细胞分组并按照“1.2.1”下的方法处理48 h。孵育后,收集细胞,用PBS洗涤2次,并悬浮在100 μl冷PBS中。将细胞悬液与1.4 ml冷的70%乙醇混合,并在20 ℃下固定过夜。将冷PBS冲洗1次,并在37 ℃下与10 μl RNase A孵育1 h,然后在4 ℃下用0.7 ml碘化丙啶染色30 min避光。远华蟾毒精组和对照组分别于24 h和48 h各检测1次。立即使用流式细胞术和FloJo软件分析细胞。

1.2.5 Transwell实验检测细胞侵袭能力:对于侵袭实验测定,用200 μl无血清培养基悬浮1×105个细胞置于带有基质胶(BD Biosciences)的上室中,下室加入含有10% FBS的培养基作为诱导剂。孵育24 h后,用甲醇将细胞固定在下表面,0.1%结晶紫进行染色。远华蟾毒精组和对照组分别于24 h和48 h各检测1次。随机选择5个场,并在显微镜(100×)下计数细胞。

1.3 观察指标 (1)比较miR-181a在胃癌患者癌组织和癌旁组织中的表达水平。(2)miR-181a表达水平与临床参数的相关性。(3)远华蟾毒精对细胞系SGC-7901细胞活力和侵袭力的影响。(4)远华蟾毒精对细胞系SGC-7901细胞凋亡率的影响。(5)远华蟾毒精对细胞系SGC-7901中miR-181a表达水平的影响。

2 结 果

2.1 miR-181a在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平比较 通过RT-qPCR检测miR-181a在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平并进行生存分析。与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-181a呈高表达(P<0.05),见图1A。miR-181a低表达的胃癌患者生存曲线优于高达表者(P<0.05),见图1B。

图1 miR-181a在胃癌组织中的表达和生存分析

2.2 miR-181a表达水平与临床参数的相关性 miR-181a高表达患者间肿瘤Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移率大于miR-181a低表达(P<0.01);miR-181a高表达与miR-181a低表达患者年龄、体质指数比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 miR-181a高表达与低表达患者临床参数比较 [例(%)]

2.3 远华蟾毒精对细胞系SGC-7901细胞活力和侵袭力的影响 远华蟾毒精组细胞系SGC-7901 24、48 h存活率及侵袭数低于对照组,浓度为0.50、1.00、1.25 μg/ml的远华蟾毒精组48 h存活率低于24 h存活率(P<0.05),见表3。

表3 对照组与远华蟾毒精组对细胞系SGC-7901细胞活力和侵袭力影响的比较

2.4 远华蟾毒精对细胞系SGC-7901细胞凋亡率的影响 浓度为1.00、1.25 μg/ml的远华蟾毒精组细胞系SGC-7901早期和晚期凋亡率及总凋亡率高于对照组,且浓度为1.25 μg/ml的远华蟾毒精组细胞系SGC-7901晚期凋亡率低于早期凋亡率(P<0.05),见表4。

表4 对照组与远华蟾毒精组对细胞系SGC-7901细胞凋亡影响的比较

2.5 远华蟾毒精对细胞系SGC-7901中miR-181a表达水平的影响 与对照组比较,浓度为1.00、1.25 μg/ml的远华蟾毒精组细胞系SGC-7901中miR-181a表达水平降低(P<0.05),且浓度为1.00 μg/ml的远华蟾毒精组48 h的miR-181a表达水平较24 h低(P<0.05),见表5。

表5 对照组与远华蟾毒精组对细胞系SGC-7901中miR-181a表达水平影响的比较

3 讨 论

蟾酥在中国的临床应用可以追溯到1 400年前,并记录在古代医学书籍《药性论》中。从历史上看,蟾酥一直被用作强心剂、利尿剂和止血剂。蟾酥被用来治疗癌症和改善免疫系统[9-10],传统中药蟾酥的提取物具有抗炎和抑制肿瘤的能力。远华蟾毒精是从传统中药蟾酥中分离出来的活性成分,具有蟾酥的药理学特性。药学科学家研究了蟾酥或蟾酥活性成分的抗癌机制,并取得了一定的研究进展,但只有少数研究集中在远华蟾毒精在癌症治疗中的作用和分子机制上。从蟾酥中提取的化学物质远华蟾毒精的功能和机制尚未得到确切定论。远华蟾毒精具有重要的抗肿瘤活性,如抑制肿瘤细胞增殖、约束细胞分化、阻断细胞周期、抑制肿瘤血管生成、阻碍肿瘤细胞转移等。梁顺添等[11]结果表明,远华蟾毒精可诱导细胞凋亡,从而明显抑制HCT116和SW480的细胞活力,这可能与P53介导的Bax通路激活和结肠癌细胞IAP通路阻断有关。作为一种化合物,远华蟾毒精已被发现具有免疫激活或抑制的作用[12]。这说明远华蟾毒精可通过调节致癌代谢通路以及患者的免疫系统而发挥抗癌功效。

miRNA是一类长度为19～22个核苷酸的小的非编码RNA。miRNA功能障碍与包括胃癌在内的各种癌症发生有关,这些miRNA可以作为肿瘤抑制因子miRNA或oncomiR[13-14]。miR-181a-5p被广泛认为与血管内皮细胞[15]和淋巴细胞[16]的发育和分化有关。此外,miR-181a-5p在多种癌症中也起着至关重要的作用,包括多发性骨髓瘤[17]、乳腺癌[18]。最新研究发现,miR-181a-5p在胃癌标本中呈上调水平[19-20]。即使在胃癌中,也有人认为miR-181a-5p通过靶向调节Prox1来抑制HGC-27细胞的迁移和增殖,基于这个发现,miR-181a-5p被认为是一种肿瘤抑制因子。相比之下,许多研究表明,miR-181a-5p通过抑制RASSF6、ATM或KLF6表达,在胃癌发生中上调并充当oncomiR[20-21]。随着miR-181a在癌症研究中的深入,越来越多证据表明miR-181a可能具有抑癌或促癌的不同性质。miR-181a可以作为致命恶性肿瘤潜在的生物标志物和治疗靶点。

由于远华蟾毒精抗癌机制尚不清晰,miR-181a在胃癌组织样本中呈现高表达,并且低表达miR-181a在胃癌患者中总生存更好。本研究利用细胞增殖实验、细胞凋亡检测和细胞侵袭功能检测判定远华蟾毒精对细胞系SGC-7901的细胞学影响,并检测不同远华蟾毒精浓度对miR-181a表达水平的影响,结果显示,远华蟾毒精组细胞系SGC-7901细胞24、48 h存活率及侵袭数低于对照组,浓度为0.50、1.00、1.25 μg/ml的远华蟾毒精组48 h存活率低于24 h存活率,表明远华蟾毒精以浓度依赖和时间依赖的方式抑制细胞系SGC-7901细胞活力,远华蟾毒精组能有效抑制细胞系SGC-7901细胞侵袭个数,且抑制作用随着药物浓度的增加而增强。浓度为1.00、1.25 μg/ml的远华蟾毒精组细胞系SGC-7901早期和晚期凋亡率及总凋亡率高于对照组,且浓度为1.25 μg/ml的远华蟾毒精组细胞系SGC-7901晚期凋亡率低于早期凋亡率,表明远华蟾毒精能有效增强SGC-7901细胞早期和晚期凋亡率,且呈药物浓度依赖性。与对照组比较,浓度为1.00、1.25 μg/ml的远华蟾毒精组细胞系SGC-7901中miR-181a表达水平降低,且浓度为1.00 μg/ml的远华蟾毒精组48 h的miR-181a表达水平较24 h低,表明远华蟾毒精可以通过下调miR-181a表达抑制细胞系SGC-7901增殖并促进SGC-7901凋亡发挥抗癌功效。因此,miR-181a表达水平在胃癌中属于风险基因,远华蟾毒精可以通过下调miR-181a表达来发挥抗癌功效,该研究为胃癌的临床治疗提供坚实的理论依据。

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