海洋沉积物中挥发性脂肪酸的测定方法优化及在胶州湾海域的应用❋

岳书香,庄光超,赵 敏,杨桂朋

(1. 中国海洋大学 深海圈层与地球系统前沿科学中心和海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室,山东 青岛 266100; 2. 崂山实验室 海洋生态与环境科学功能实验室,山东 青岛 266237; 3. 中国海洋大学 化学化工学院,山东 青岛 266100)

海洋占据地球表面约71%的面积,是地球上最大的生态系统。海洋沉积物中埋藏着大量的微生物,其生物量与整个海洋水体中的生物量相当[1]。作为沉积物中微生物的重要能量来源,挥发性脂肪酸(VFAs)是海洋沉积物中厌氧代谢和有机质降解的关键化合物,是生物大分子与最终再矿化产物甲烷和二氧化碳的重要中间产物[2]。

图1 乙酸作为海洋沉积物碳循环中心示意图[10]Fig. 1 Schematic representation of acetate as a centre of carbon cycling in marine sediments[10]

孔隙水中的VFAs浓度决定了沉积物微生物群落特定代谢过程的能量可用性[11-13],测定沉积物中的VFAs浓度及其深度剖面,有助于解释沉积物中相关微生物过程的分布特征、控制因素及能量代谢途径[14-16]。此前已有许多方法可用于测定沉积物孔隙水中VFAs浓度,但都有一定的局限性。表1总结了已有的测定沉积物孔隙水中VFAs的方法,以及每种方法测定的VFAs种类、检出限及其优缺点。Parkes和Taylor[17]在1983年采用离子色谱电导率检测方法对海洋沉积物孔隙水中的有机酸进行了分析,该方法需要先通过真空蒸馏将样品中的有机酸与无机盐分离,乙酸和丙酸的检出限为1～2 μmol/L,但不能对甲酸、丁酸及戊酸进行定量分析。King[18]使用酶法对孔隙水中乙酸盐浓度进行了测定,检出限可达100 nmol/L,但该方法不能用于测定其他有机酸。Yang等[19]利用静态扩散池将海水中的有机酸进行预浓缩,然后使用气相色谱法对乙酸进行定量分析,该方法的检出限为低纳摩尔范围内。Mueller-Harvey和Parkes[20]使用衍生化方法对海洋沉积物孔隙水进行了前处理,使用HPLC对C2—C5有机酸进行了测定,检出限为0.5 μmol/L,但由于存在干扰峰,该方法不能对乙酸盐进行定量分析。此外,Vairavamurthy和Mopper[21]使用衍生化方法对孔隙水样品进行前处理,随后使用气相色谱结合氮选择性检测器对衍生化后的物质进行分析,检出限为亚微摩尔。相比之下,Albert和Martens[22]利用高效液相色谱测定孔隙水中VFAs的方法,可用于分析C1—C5范围内的VFAs,且有较高的灵敏度和较低的检出限。该方法能够满足测定海洋沉积物孔隙水中VFAs浓度的需求,本文通过方法优化和改进,建立衍生化结合液相色谱仪对海洋沉积物孔隙水中VFAs的测定方法,并使用此方法对胶州湾沉积物孔隙水中的VFAs进行了测定。

表1 沉积物孔隙水中VFAs的测定方法、种类、检出限及优缺点Table 1 Determination methods,types,detection limits,advantages and disadvantages of VFAs in sediment porewater

1 仪器试剂与色谱条件

1.1 主要仪器与试剂

岛津LC-16P制备液相色谱仪(日本岛津公司)。SPD-16紫外可见检测器(日本岛津公司)。H1750R高速冷冻离心机(湖南湘仪公司)。XDB-C8分析色谱柱(美国安捷伦公司)。PRP-1 HPLC保护柱(瑞士Hamilton公司)。

乳酸钠溶液(60%)、甲酸钠(99%)、乙酸钠(99%)、丙酸钠(99%)、正丁醇(99.7%,色谱纯)、四丁基氢氧化铵(40%)、溴化十四烷基三甲基铵(99%)、2-硝基苯肼(97%)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、吡啶(99.8%)、磷酸(85%,色谱纯),以上试剂均经上海sigma公司购买。盐酸(优级纯,南京化学试剂有限公司)、KOH(85%,国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 色谱分析

流动相A和B成分相似,1 L流动相A主要包括2.5%正丁醇、50 mmol/L乙酸钠、2 mmol/L 四丁基氢氧化铵(TBAOH)、2 mmol/L 溴化十四烷基三甲基铵(TDTMABr)和0.5 g硅胶,加入硅胶的主要目的是保护色谱柱填料。溶液混合均匀后用磷酸调节pH至4.5。流动相B和A的区别在于B中TDTMABr的浓度为50 mmol/L,其他物质浓度均一致。流动相需用0.45 μm聚醚砜滤膜过滤。

液相配备0.5 mL定量环,进样方式为手动进样,为了确保将定量环中的液体全部置换,需要用注射器吸取1.5～2 mL的样品(将定量环中的液体全部置换需要至少三倍定量环体积的样品)。紫外检测器设定波长为400 nm。液相色谱中流速可影响色谱峰的分离、峰型和保留时间,Agilent XDB-C8反相液相色谱柱的最佳流速为1 mL/min。为了保持色谱柱的最佳性能,将流速设定为1 mL/min。经过大量实验,最终设定的洗脱程序如表2所示。流动相由初始100% A在5 min内逐渐过渡至100% B,持续25 min,在1 min内由100% B过渡为100% A,持续14 min,分析总时间为45 min。

表2 洗脱程序Table 2 Elution Procedure

2 衍生化方法优化及评价

2.1 衍生化方法

因VFAs本身无紫外吸收,标准溶液和样品中的VFAs需经过衍生化处理才能实现对其定量检测的目的。在水溶液中,有机酸可与2-硝基苯肼(NPH)偶联生成2-硝基苯肼衍生物,这些衍生物可与甲醇-水或乙腈-水溶剂体系分离,并能在可见光400 nm波长处被检测到。因此,本实验使用NPH作为衍生化试剂,紫外检测器吸收波长设定为400 nm。

此外,pH是衍生化成功的一个重要条件。在衍生化之前,加入吡啶-盐酸缓冲溶液使样品的pH控制在3.5～5范围内。在此pH范围内,溶液衍生化后的颜色为橙红色,表明衍生化过程成功。若衍生化后的样品颜色为橙黄色,表明溶液pH偏低,衍生化失败。样品中的CO2会影响衍生化过程中的pH,导致样品衍生化失败。此外,NPH可将CO2衍生化,产生一种不稳定的衍生物,与有机酸的色谱峰共洗脱。为保证样品衍生化成功,在加入吡啶-盐酸缓冲溶液后使用N2吹扫4～5 min即可消除CO2的影响。

样品的前处理步骤如下:

(1)配制吡啶-盐酸比例为1∶1的缓冲溶液,在2 mL水样中添加0.2 mL吡啶-盐酸缓冲液(添加试剂体积为样品体积的10%),混合后用N2吹扫4～5 min。

(2)配制 0.1 mol/L NPH的盐酸溶液,盐酸浓度为0.25 mol/L。添加0.2 mL该溶液于水样中,涡旋混合。

(3)配制0.3 mol/L EDC溶液,添加0.2 mL EDC溶液,涡旋混合。

分析可知，上游坝坡坡脚采用砂岩压重处理后，5种工况下大坝上游坝坡的安全系数增大明显，坝体稳定性显著提高，均满足规范要求。本工程在加固前上游坝坡在正常蓄水位、设计洪水位、校核洪水位、校核洪水位降至正常蓄水位和正常蓄水位情况下，骤降至死水位时，安全系数分别为1.19，1.20，1.23，1.14，0.98；而采用砂岩压重处理后5种工况对应的上游坝坡安全系数分别增加到1.41，1.53，1.58，1.47，1.27。说明除险加固设计采用的砂岩压重措施效果十分显著。

(4)将上述样品置于黑暗处衍生化1.5 h。

(5)配制6 mol/L HCl溶液,添加0.2 mL该溶液于样品中,涡旋混合。

(6)1 min后,添加0.2 mL 40% KOH(w/v)溶液,涡旋混合。

(7)70 ℃水浴加热10 min后,冷却、离心,取上清液进行液相分析。离心机的温度、转速和时间分别设置为25 ℃、5 000 r·min-1和5 min。

为保证衍生化方法的准确性,对衍生化方法进行了优化,步骤(5)为实验优化后添加的步骤,具体优化过程见2.2.1。

2.2 方法优化

2.2.1 标准曲线线性优化 实验过程中使用Milli Q水配制标准溶液,标准溶液进行衍生化处理后可上机测定并绘制标准曲线。经液相测定,乙酸盐的标准曲线并没有良好的线性。经过多次实验,排除了人为的操作污染,可能是衍生化试剂导致。为保证标准溶液和样品衍生化完全,加入的衍生化试剂是远远过量的。而流动相A和B中均含有50 mmol/L的乙酸钠,样品中未反应完全的衍生化试剂可将流动相中的乙酸钠衍生化,造成一个不稳定的空白峰面积。在衍生化过程结束后加入0.2 mL 6 mol/L的盐酸溶液可使EDC试剂失活,从而避免衍生化试剂将流动相中的乙酸钠衍生化。为探究未反应完全的衍生化试剂是否会对标准曲线的线性造成影响,设计了相关的对照实验。以未在衍生化结束后加入盐酸溶液的标准溶液作为对照组,加入盐酸后的标准溶液作为实验组。对照组和实验组中不同浓度下乙酸的峰面积如表3所示。

表3 对照组和实验组中不同浓度下乙酸盐的峰面积Table 3 Peak areas of acetate at different concentrations in the control and experimental groups

实验组中乙酸盐的空白峰面积降低了30.6%,表明流动相中的乙酸钠能够与衍生化试剂发生反应。为探究加入盐酸对改进标准曲线的线性是否有效,对以上两组实验绘制了线性图表,标准曲线如图2所示。

图2 对照组和实验组的标准曲线Fig.2 Standard curves for control and experimental groups

实验组的标准曲线线性较好,线性相关系数为0.996 8,而对照组的线性相关系数为0.973 3,标准曲线线性较差。为避免实验的偶然性,重复7次实验,线性相关系数分别为0.992 1、0.997 3、0.989 6、0.992 4、0.997 8、0.994 5和0.995 1,平均值为0.994 1。表明在衍生化过程结束后加入盐酸可改进标准曲线的线性,线性相关系数大都在0.99以上。因此,为保证标准曲线的良好线性,在衍生化过程结束后,需要加入0.2 mL 6 mol/L的盐酸溶液。

此外,加入盐酸也能降低乙酸盐的空白峰面积。此时乙酸盐的检出限为5 μmol/L,而沉积物孔隙水中乙酸盐的浓度为微摩尔级别,该检出限并不能满足沉积物孔隙水中乙酸盐浓度的测定。如何降低乙酸盐的空白成为了需要重点解决的问题。

2.2.2 乙酸盐的空白优化 衍生化过程中加入的试剂种类繁多,可能增加乙酸盐的空白峰面积。于Sigma公司购买的NPH试剂含有较多杂质,用于配制溶液时并不能完全溶解,需要进行纯化。采用冷冻干燥的方式对NPH进行纯化,冷冻干燥的具体步骤为:将NPH粉末充分溶解在70 ℃水中,过滤掉不溶的杂质,将得到的滤液进行冷冻,待滤液冷冻完全后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥,24 h即可。冷冻干燥后得到的NPH粉末用于配制溶液时即可完全溶解。此外,高纯度吡啶试剂中的有机酸污染比较严重,因此需要对吡啶进行蒸馏纯化。吡啶沸点为115.2 ℃,蒸馏时取115 ℃左右的馏分。为探究以上实验是否能够降低乙酸盐的空白峰面积,将纯化后的NPH和吡啶均用于配制试剂,得到的乙酸盐标准曲线如图3所示。

图3 乙酸盐的标准曲线Fig.3 A standard curve for acetate

使用纯化后的试剂配制溶液,乙酸盐的空白峰面积降低了62.0%,同时标准曲线的线性也得到了提升,线性相关系数为0.999 2,高于0.999。后续进行多次实验,标准曲线的线性相关系数均高于0.999,表明以上的优化过程是有效的。此时乙酸盐的检出限降低至原来的十分之一,为0.5 μmol/L。

2.3 方法评价

对乳酸盐、乙酸盐、甲酸盐和丙酸盐的混合标准溶液经衍生化处理并进行液相分析,最终得到的四种VFAs标准色谱图如图4所示。

图4 四种VFAs的液相色谱图Fig.4 Liquid chromatogram of four VFAs

色谱峰洗脱先后顺序为乳酸盐、乙酸盐、甲酸盐和丙酸盐,保留时间分别为9.6、10.8、11.9和13.6 min。

配制一定梯度的甲酸钠、乙酸钠、丙酸钠和乳酸钠混合标准溶液,得到的各VFAs标准曲线线性相关系数均需大于0.999。配制1 μmol/L的标准溶液,对标准溶液进行衍生化处理,按照具体色谱条件进行分析,当日平行进样7次,记录峰面积,计算精密度 (RSD)。实验得到的乳酸盐、乙酸盐、甲酸盐和丙酸盐的保留时间、回归方程、线性相关系数、检出限和精密度等如表4所示。

表4 乳酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐的保留时间、回归方程、检出限和精密度Table 4 Retention time,regression equation,detection limits,and precision of lactate,formate,acetate and propionate

四种VFAs的标准曲线线性良好,线性相关系数均大于0.999,精密度均在10%以内,有较好的重现性。这四种物质中,乳酸盐的空白峰面积小,检出限最低,为0.2 μmol/L。而乙酸盐的空白峰面积在经过实验优化和试剂纯化后仍不可忽略,实验中得到的最低检出限为0.5 μmol/L。丙酸盐的空白较低,其检出限可达0.3 μmol/L。甲酸盐的重现性好,且空白低,检出限为0.3 μmol/L。在Albert和Martens[22]的方法中,乳酸盐、乙酸盐和甲酸盐的精密度分别为3.8%、1.3%和1.9%,检出限为低纳摩尔范围(由于空白的不确定性,最低约为500 nmol/L),没有对丙酸盐的精密度和检出限进行探究。优化后的方法具有较高的精密度和较低的检出限,可用于海洋沉积物孔隙水VFAs浓度的测定。

3 方法应用

胶州湾位于山东省青岛市内,是一个半封闭海湾,面积为320 km2,是中国较大的优良港湾。于2020年12月27日前往胶州湾大沽河口进行了沉积物采样工作,该区域内的优势植被为互花米草。A取样点位于大沽河河口潮间带地区(36.28°N,120.22°E),如图5所示。采样点处于河口区,沉积速率较快,有机质相对新鲜且易降解。选取采样点A的四个采样站位进行采样,获得的沉积物是典型的潮间带沉积物,使用Rhizon采样器抽取孔隙水进行测定分析。

利用以上的操作方法,对胶州湾的部分孔隙水样品的VFAs进行测定,孔隙水在进行实验前需用0.22 μm聚醚砜滤膜过滤,按照上述实验步骤进行衍生化处理,经衍生化后的样品用注射器吸取注入液相色谱进行分析,样品的液相色谱图如图6所示。

图6 样品的液相色谱图Fig.6 Liquid chromatogram of the sample

孔隙水样品的色谱图中存在较多杂峰,但不会对目标色谱峰造成影响,且乳酸盐、乙酸盐和甲酸盐的保留时间与标准相似。此外,实验测得的数据如表5所示。

表5 胶州湾地区部分样品的甲酸盐和乙酸盐浓度数据Table 5 Formate and acetate concentration data of some samples in the Jiaozhou Bay area

由表5可知,胶州湾沉积物孔隙水中主要检测到乙酸盐和甲酸盐,且乙酸盐浓度均高于甲酸盐浓度。乙酸盐的浓度变化范围为2.2～17.4 μmol/L,均高于检出限,且乙酸盐的精密度为1.9%,可以满足测定胶州湾河口沉积物孔隙水中乙酸盐浓度的测定要求。甲酸盐浓度的变化范围为0.4～6.5 μmol/L,其中三个样品的甲酸盐浓度低于检出限(0.3 μmol/L),甲酸盐的精密度为1.2%,表明该方法可满足该区域多数孔隙水样品中甲酸盐浓度的测定。

沉积物孔隙水中乙酸盐的浓度反映了生物生产及消耗作用的平衡。生物生成乙酸盐的途径主要是厌氧发酵及产乙酸菌利用CO2和H2自养产乙酸。乙酸盐浓度受产乙酸菌、产甲烷菌、硫酸盐还原菌、反硝化菌和铁锰还原菌等多种微生物控制。不同站位沉积物中乙酸盐的浓度有差异,主要受硫酸盐还原过程、甲烷产生过程和硝酸盐还原过程和铁锰还原过程的影响。

该区域乙酸盐表层低底层高的分布特征表明表层沉积物中有足够的的电子受体,乙酸盐被微生物迅速消耗,保持在较低的水平。而随着深度的增加,乙酸盐的生成过程超过消耗过程,导致乙酸盐的积累。而甲酸盐主要来源于有机质发酵过程,不同站位的有机质发酵速率不同,导致了甲酸盐的浓度差异。

4 结语

本文对衍生化结合液相色谱测定海洋沉积物孔隙水中VFAs的方法进行了优化,通过加入盐酸和纯化衍生化试剂,改善了标准曲线的线性,降低了乙酸盐的检出限。四种VFAs的线性相关系数均高于0.999,乙酸盐的检出限由5 μmol/L降低至0.5 μmol/L,乳酸盐、甲酸盐和丙酸盐的检出限分别为0.2、0.3和0.3 μmol/L。使用此方法对胶州湾沉积物孔隙水中的VFAs进行了测定,乙酸盐的浓度变化范围为2.2～17.4 μmol/L,甲酸盐的浓度变化范围为0.4～6.5 μmol/L,乙酸盐浓度均高于甲酸盐浓度。此方法具有较高的灵敏度和较低的检出限,可用于海洋沉积物孔隙水中VFAs的浓度测定。