肌层浸润性膀胱癌分子分型研究进展

孙杨 马强 郑克文 魏义举 居红格

膀胱癌是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤。据统计，2020 年全球新增膀胱癌近60 万例，膀胱癌死亡超21 万例[1]。根据2022 年国家癌症中心最新数据统计，2016 年我国膀胱癌年新增8.23 万例，死亡3.37 万例[2]。目前关于膀胱癌的致病原因尚未明确，可能与长期吸烟、工业染料接触有关，同时与年龄、性别及家族史也有一定的关系[3]。在膀胱癌患者中，约75%在初诊时为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）[4]，且超过50%的NMIBC 术后2 年内复发。肌层浸润性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC）具有进展快、易复发、预后差的特点[5-6]，约占膀胱癌的15%～20%。目前对于MIBC 的标准疗法是新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NAC）后行膀胱根治性切除术[7]，与单独行根治性膀胱切除术相比，NAC 联合根治性膀胱切除术后患者5 年生存率提高5%～8%[8]。同一种病理类型、分级、分期的膀胱癌患者对化疗药物的敏感性亦有差异，因此相同治疗方式可能产生不同的治疗效果[9]，这种膀胱癌的生物异质性给治疗带来了很大的困难和挑战。在临床上，因年龄、肾功能不全及心理因素等导致无法行NAC 的MIBC 患者高达50%[8]，而自2016 年获批的免疫检查点抑制剂为这些患者提供了新的辅助治疗思路，且其不良反应发生率较全身化疗明显降低。近年来，随着基因组学和高通量测序技术的发展，人们对MIBC 分子分型有了初步的认识，这将有助于更好地理解膀胱癌的发病机制，寻找对治疗和预后有潜在价值的生物标志物，以进一步指导临床治疗。因此，本文从MIBC 分子特征及7 种分子分型展开，对MIBC 分子分型研究进展作一综述。

1 MIBC 分子特征

分子遗传学证据表明，膀胱癌发生的2 条不同致病途径对应于2 种不同生物学及临床表型[10]；但在这2条不同致病途径中都会发生且发生最早的基因变化是9 号染色体缺失，它是导致尿路上皮细胞异常增殖并向尿路上皮癌进展的关键因素，常见于9q34.1 至9p12 杂合性缺失。由于该区域存在着某些肿瘤抑制基因，缺失后会导致细胞过度增殖。NMIBC 通常由尿路上皮过度增生发展而来，受到多条通路及多个基因的影响，如成纤维细胞生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3）/RAS 通路、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的改变。RAS 可通过自身突变激活下游的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），也可被上游的FGFR3 激活[11]，诱导肿瘤细胞过度增殖。FGFR3 可以激活PI3KAKT-mTOR 通路，从而促进膀胱癌的发生、发展。肿瘤蛋白53（tumor protein 53，TP53）/视网膜母细胞瘤基因1（retinoblastomal 1，RB1）通路的改变以及其下游基因p14、p16、p21、p27、细胞周期蛋白（cyclin，CCN）D1、CCND3 的突变可使尿路上皮异型增生进展为原位癌甚至MIBC。MIBC 遗传改变主要涉及各种肿瘤抑制基因，这些基因编码调控细胞周期和凋亡途径的蛋白，包括TP53、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin dependent kinase inhibitor，CDKN）2A、RB1、染色体10上缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）、CCND1、CDKN1B 等。p53 蛋白可以通过其下游的RB蛋白来调节细胞周期，RB 基因通过结合E2F 导致基因突变失活，影响细胞周期G1/S 期，从而抑制细胞周期进展，进而抑制膀胱癌的发生、发展[12-14]。p53、RB 基因突变后，MDM2（p53 抑制因子）、CCND1、CCNE1 基因被活化，进而发生扩增或过表达并抑制CDKN2A，导致p53 蛋白活性完全丧失，上述这些基因改变导致MIBC具有较高的增殖活性。

2 MIBC 分子分型

美国国家癌症研究所于1999 年首次提出癌症分子分型的概念，旨在通过基因分析技术将传统的肿瘤形态学分型转变为以分子生物学特征为基础的分子分型，从而为肿瘤的精准诊疗提供依据。目前常用的MIBC 分子分型方法有以下7 种，主要包括UNC 分型、MDA 分型、癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）分型、Lund 分型、Bold 分型、基于NAC 反应的分子分型、基于共识的MIBC 分子分型。

2.1 UNC 分型 2014 年Damrauer 等[15]通过对262 例MIBC 患者的基因表达进行共识聚类分析，提出了2 个亚型：管腔型和基底型。管腔型高表达尿路上皮伞细胞的标志物低分子量角蛋白（keratins，KRT）20 以及尿路上皮特异蛋白UPK1B、UPK2 和UPK3A，患者预后较好。基底型尿路上皮基底细胞中高表达高分子量KRT14、KRT5、KRT6B 以及CD44，患者预后较差。基底型肿瘤常有RB1 通路的基因发生改变，如RB1 突变或缺失，还有CCND1、CCNE1、E2F 转录因子3（E2F transcription factor 3，E2F3）等。基底型肿瘤中有1 个特殊类型，即Claudin-low 亚型，此亚型高表达上皮-间充质转化（epithelial to mesenchymal，EMT）标志物和干细胞标记基因，但低表达紧密连接蛋白。

2.2 MDA 分型 2014 年Choi 等[16]通过对73 例MIBC患者的mRNA 进行分析，提出了3 个亚型：基底型、管腔型、p53 型。基底型高表达KRT5、KRT6、KRT14，并存在CD44、CDH3、p63 高表达；且其具有肉瘤样特征，易发生转移，患者总体生存期较短，预后较差。管腔型高表达KRT20 以及尿路上皮细胞分化相关标志物，过氧化物酶体增殖因子激活受体（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）相关通路活性很强，高表达过氧化物酶体增生激活受体γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG）及FABP4 基因。此外，转录因子叉头框家族蛋白A1（forkhead box protein Al，FOXA1）、谷氨酰基-tRNA 酰胺转移酶连接蛋白3（glutamyl-tRNA amidotransferase binding protein 3，GATA3）、UPK、FGFR3、erb-b2 受体酪氨酸激酶（erbb2 receptor tyrosine kinase，ERBB）2 和ERBB3 基因激活突变也很常见，故针对ER、PPARG、FGFR3 靶向药物的治疗可能在这一型中起作用。由于许多管腔型肿瘤对NAC 有反应，靶向治疗应与常规化疗结合应用，以获得最大疗效。p53 型和管腔型肿瘤mRNA 表达谱类似，均表达管腔样标志物，但在p53 型中，野生型p53基因显著激活。

2.3 TCGA 分型 2014 年TCGA 研究团队基于131 例患者的RNA、DNA 和蛋白质表达谱进行数据分析，提出了4 个分子分型：ClusterⅠ型、Cluster Ⅱ型、Cluster Ⅲ型、Cluster Ⅳ型[17]。随后，Aine 等[18]研究发现不同分子分型方法之间存在一定的对应规律，其中Cluster Ⅰ型对应MDA 分型的管腔型，Cluster Ⅱ型对应MDA 分型的p53 型，Cluster Ⅲ型和ClusterⅣ型对应UNC 分型的基底型。ClusterⅠ型肿瘤具有FGFR3 基因高突变率，病理类型上大部分为乳头状癌，预后较好。ClusterⅡ型肿瘤对程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PDL1）抑制剂高度敏感，而对NAC 敏感性较差。Cluster Ⅲ型高表达细胞角蛋白KRT5、KRT14，这2 种角蛋白为标记干细胞的蛋白，此型具有鳞状分化和干细胞表达特征，预后较差。Cluster Ⅳ型则以EMT 为特征，表达波形蛋白和N-钙黏蛋白，并表现出黏附基因CDH1、claudin等缺失，以及EMT转录因子SNAI2过表达。

2017 年Robertson 等[19]对412 例MIBC 患者的基因表达数据进行分析，将MIBC 分成5 个分子亚型：单纯管腔型、管腔乳头型、管腔浸润型、基底鳞状细胞癌型和神经元型。单纯管腔型高表达UPK1A、UPK2、CK20和SNX31。管腔乳头型基因改变包括FGFR3 基因高突变率、转录相关酸性卷曲蛋白3（transforming acidic coiledcoil containing protein 3，TACC3）融合和（或）扩增、低甲基化水平。管腔浸润型肿瘤高表达平滑肌和肌纤维母细胞基因，并表达免疫标记基因程序性细胞死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）和PD-L1。Rosenberg 等[20]认为抗PD-L1 治疗对管腔浸润型肿瘤最有效。基底鳞状细胞癌型高表达CD44、CK5、CK6A和鳞状分化标记基因，也有免疫标记基因高表达。神经元型高表达神经分化和发育标记基因PLEKHG4B、SOX2、MSI1 和GNG4 等，也存在p53 通路的基因改变，是各亚型中预后最差的一种。

2.4 Lund 分型 2010 年Lindgren 等[21]对144 例膀胱癌数据进行全基因组阵列比较基因杂交和基因表达分析，确定了2 个分子亚型：MS1 型和MS2 型。MS1 型常见FGFR3 和磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α（phosphoinositide 3 kinase catalytic alpha polypeptide，PIK3CA）基因的突变；MS2 型表现出显著的基因组不稳定性，常见RB1 缺失、E2F3 扩增及TP53/MDM2 改变。大多数MIBC 为MS2 型，而NMIBC 为MS1 型。

2012 年来自Lund 大学的Sjodahl 等[22]收集了308份膀胱癌样本的转录组数据，提出了5 个分子亚型：Urobasal A 型、Urobasal B 型、基因不稳定型、鳞状细胞癌型、浸润型。Urobasal A型过表达FGFR3、TP63、CK5，与早期细胞周期相关基因（CCND1）和细胞黏附相关基因的表达也升高，此型常见于浅表性癌。基因组不稳定型有TP53 突变、ERBB2 表达以及PTEN、CK 低表达，与免疫标记和晚期细胞周期相关基因（CCNA、CCNB、CCNE）的表达升高。Urobasal B 型、鳞状细胞癌型、浸润型均高表达免疫标记基因；Urobasal B 型有TP53 突变，同时存在Urobasal A 型亚型的基因突变；鳞状细胞癌型高表达基底型角蛋白CK5、CK6 和CK14等。2017 年Lund 大学研究团队进一步采取免疫组织化学方法分析了307 例MIBC 组织标本，使用28 种蛋白的抗体和基因表达进行分析并将MIBC 分为以下5个分子亚型：尿路上皮型、基因不稳定型、基底鳞状细胞癌型、间充质型、小细胞/神经内分泌型[23]。

2.5 Bold 分型 2019 年Tan 等[24]分析了来自TGGA、UROMOL、IMvigor 210 发表研究的2 411 例膀胱癌基因表达数据，把膀胱癌重新划分为6 个分子亚型：管腔型、乳头型、神经元型、HER2 型、鳞状细胞癌型、间充质型。管腔型具有更强的MAPK 信号转导，KRAS 和KMT2 C/D 基因突变也较多，其主要为NMIBC，预后较好。乳头型高表达尿路上皮分化基因以及FGFR3 突变、扩增和FGFR3-TACC3 融合，其主要为NMIBC。神经元型肿瘤的特点是高表达WNT/β-catenin 信号，主要为MIBC。HER2 型肿瘤在NMIBC 与MIBC 中所占比例较为均衡，以ERBB2 高扩增和信号转导为特点。鳞状细胞癌型表达鳞状上皮分化基因，还高表达PD-1、细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxicT-lymphocyte-associatedprotein 4，CTLA4）信号以及存在相关免疫通路的激活，此型预后最差，在晚期和高级别肿瘤中丰富，易发生淋巴结转移。间充质型主要为MIBC，高表达AXL 信号。神经元型、间充质型和鳞状细胞癌型中PD1 和CTLA4 高表达，提示它们可能是免疫检查点的潜在治疗靶点。

2.6 基于NAC 反应的分子分型

2.6.1 GSC 2017 分型 Seiler 等[25]对343 例MIBC 患者的基因表达数据进行分析，根据已公开发表的4 种分子分型方法（UNC 分型、MDA 分型、TCGA 分型、Lund分型）建立1 个单样本基因组亚型分类器GSC，并研究其对NAC 的反应性，同时与未经NAC 的患者进行比较，最终根据对NAC 的反应性将MIBC 分为4 个亚型：claudin-low 型、基底型、管腔型、管腔浸润型。管腔型患者的预后最好，NAC 的使用与否影响不大。管腔浸润型肿瘤患者的病理分期和预后明显差于管腔型肿瘤患者，无论有无NAC，预后较差。claudin-low 型肿瘤患者从NAC 中获益很少或根本没有，其预后最差。NAC 对基底型肿瘤患者具有巨大的益处，使用NAC 后患者预后得到明显改善。

2.6.2 Seiler 2018 分型 肿瘤的生物学行为和临床特点会受到NAC 的影响，NAC 可能诱导亚型转换，导致肿瘤分子分型在NAC 前、后出现不一致。Seiler 等[26]利用转录组全基因表达检测和免疫组织化学方法对133例NAC 前、后的MIBC 组织样本进行研究，将NAC 耐药患者分为4 个主要分子亚型：CC1-基底型、CC2-管腔型、CC3-免疫型、CC4-瘢痕型。CC1-基底型和CC2-管腔型的表型不受NAC 影响，无论是否使用NAC 都分别表现为基底和管腔表型，表达其对应相关标志物。CC3-免疫型和CC4-瘢痕型在NAC 后，缺乏基底样和管腔样标志物的表达。CC4-瘢痕型在4 个亚型中免疫活性最高[27]，趋化因子、细胞因子、免疫相关基因的表达均较高。CC4-瘢痕型高度表达纤维化和ECM 标志物，与导致瘢痕形成的伤口愈合反应一致。

2.7 基于共识的MIBC 分子分型 2020 年Kamoun等[28]使用来自18 个数据集的1 750 个MIBC 转录图谱进行数据分析，得出一个共识分类，定义了以下6 个亚型：管腔乳头型、管腔不稳定型、管腔非特异型、基底/鳞状型、神经内分泌型、富基质型。管腔乳头型高表达FGFR3、赖氨酸去甲基化酶6A（lysine demethylase 6A，KDM6A）基因，也存在CDKN2A 的丢失[29]。管腔非特异型肿瘤主要表现为E74 样因子3（E74 like ETS transcription factor 3，ELF3）和PPARG 的突变，存在间质浸润的特征表达，高表达纤维母细胞标志物，同时有T 细胞和B 细胞免疫浸润。管腔不稳定型肿瘤具有更频繁的PPARG 改变和含有E2F3 和S0X 4 的6p22.3区域的高水平扩增。与其他管腔类型不同，管腔不稳定型肿瘤与TP53 和切除修复交叉互补基因（excision repair crosscomplementing rodent repair deficiency gene 2，ERCC2）突变相关，此型是6 个亚型中基因组改变最多的类别，具有较高的细胞周期活性表达。基底/鳞状亚型肿瘤主要是TP53 和RB1 突变，也与3p14.2 基因组缺失密切相关，其伴有STAT3、HIF1A、EGFR 调节因子活性增强，并富于细胞毒性及自然杀伤淋巴细胞群。富基质型肿瘤主要特征为平滑肌、内皮细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞基因过表达，并伴有T 细胞和B细胞免疫浸润。神经内分泌亚型肿瘤主要为TP53 和RB1 基因同时突变或缺失，高度表达神经内分泌相关标志物，对NAC 治疗敏感[30]。

3 小结与展望

综上所述，MIBC 主要分为管腔型、基底型、神经元型。其中管腔型根据病理特点、分子表现的不同又分为单纯管腔型、管腔乳头型、管腔浸润型；基底型中有一类伴鳞状上皮细胞分化的肿瘤较为特殊，称为基底鳞状细胞癌型。管腔型高表达尿路上皮分化标记相关基因Uroplakins 和FOXA1，此型预后较好。许多管腔型肿瘤对NAC 有反应，但敏感性较低，管腔型主要表现为FGFR3 基因突变，故联合应用FGFR3 靶向药物和常规化疗可以获得最大疗效。基底型肿瘤高表达尿路上皮基底细胞标志物KRT5、KRT6、KRT14 以及CD44。基底型肿瘤患者NAC 后预后得到明显改善，但在单纯外科手术治疗时预后较差，因此对于基底型肿瘤患者应该优先接受NAC。神经元型高表达与神经内分泌标记相关基因，以高增殖性为特点，此型预后最差，对NAC 治疗敏感，该亚型肿瘤建议联合应用依托泊苷和顺铂治疗。

随着单细胞高通量测序技术、质谱检测、免疫分析和其他技术的迅速发展，MIBC 分子分型标准也在不断完善，但仍存在一定的局限性。目前，肿瘤分子分型以基因组和转录组的研究为主，但蛋白质组学和肿瘤的免疫状态也与肿瘤进展密切相关。因此，有关肿瘤分子分型的研究应考虑纳入更多组学，以期得到更加精确可靠的分子分型标准。在未来，这些分子分型标准将是对传统病理学分类的一种有力补充。