猪流行性腹泻病毒Nsp7 基因真核表达载体的构建及表达

魏佳琪，高振秋，郑亮，牛欣雨，武峰峰，吴春宇，王志昊，张华，曹宏伟，，

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院；3.盐城师范学院）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的病毒性疾病，该病极具传染性。PEDV 主要是引发肠道炎症，对肠道造成损害，包括绒毛萎缩和脱落[1-2]。PEDV 为有囊膜的5’端加帽、3’端ploy（A）尾的单股正链RNA 病毒，是α 冠状病毒家族中的一员，基因组核苷酸大约28 000 nt[3-4]。在PEDV 的基因组中，有三分之二的基因编码非结构蛋白，即复制酶蛋白1a 和1b。它们在自身编码的剪切酶的作用下被剪切成16 个非结构蛋白（Nsp1-Nsp16），这些非结构蛋白在PEDV 复制、装配和逃避宿主天然免疫中发挥重要的作用[5]。PEDV 编码的23个病毒蛋白中，已被证实有11 个蛋白能够拮抗干扰素的产生，从而逃避宿主天然免疫[6]。

PEDV Nsp7 蛋白分子量约为10 kDa，编码83 个氨基酸，属于疏水性蛋白质。PEDV Nsp7 蛋白与病毒的复制以及病毒粒子的组装有关[7-9]。研究发现，冠状病毒Nsp7 可以抑制宿主天然免疫，拮抗IFN 免疫应答[10]。冠状病毒编码的非结构蛋白在病毒RNA 的合成、加工以及病毒-宿主相互作用中发挥多种功能，其中Nsp7 至Nsp10 蛋白可以作为这些酶的关键辅助因子[11]。

到目前为止，关于冠状病毒Nsp7 作用机制方面的研究报道较少，对于PEDV Nsp7 蛋白也是如此。为进一步研究PEDV Nsp7 蛋白的生物学功能，研究构建了PEDV Nsp7 基因的真核表达质粒，并通过Western Blot 及间接免疫荧光技术确定PEDV Nsp7蛋白在细胞中成功表达。研究为后续制备抗PEDV Nsp7 蛋白的多克隆抗体以及PEDV Nsp7 蛋白的生物学功能研究奠定了一定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与质粒

猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）、人肾上皮细胞（HEK-293T）均保存于实验室；胎牛血清（FBS）和DMEM 培养基购自Gibco 生物公司；质粒pCMVMyc 由实验室保存；感受态细胞DH5α 购自北京天根生物技术有限公司；患有PED 的仔猪病料采集于黑龙江省大庆市某猪场，并保存在实验室-80 ℃冰箱。

1.2 主要试剂与抗体

MLV 逆转录酶、PCR 试剂盒、限制性内切酶、无缝克隆酶2×Seamless、M-MLV 反转录酶、ExTaq 热启动DNA 聚合酶购自Takara 公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen 公司；DNA 胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于Omega 公司；基因特异性引物的合成及重组质粒的序列测定均由擎科（北京）公司完成；小鼠抗Myc 标签单体克隆抗体（TA-01）购自碧云天生物技术有限公司；兔抗β-actin 单克隆抗体（ZM-0001）、HRP 标记的山羊抗小鼠IgG（ZB-2305）、HRP 标记的山羊抗兔IgG（ZB-2301）、FITC 标记的山羊抗小鼠IgG（ZB-0312）购自中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 引物的设计

以已经发表在GenBank 网站中的PEDV 毒株基因序列为根据，利用软件Primer 5.0 进行PEDV Nsp7基因上、下游引物设计。特异性上游引物序列：5′-GCCATGGAGGCCCGAATTCGGATGTCTAAACTGA -CTGATATTAAGTGTA-3′（包含EcoRⅠ酶切位点），特异性下游引物序列：5′-CGCGGCCGCGGTACCTCGAGAACTCTGCAACATA C TATTGTC ATTAA-3′（包含XhoⅠ酶切位点）。

1.4 PEDV Nsp7 基因的RT-PCR 扩增

将保存的病变猪小肠用液氮研磨，将其放于1.5 mL EP 管中，进行剧烈摇晃1 min 后静止15 min，将EP 管放入冰盒中，加入200 μL 三氯甲烷，快速摇晃20 s 后静置15 min。将低温静置后的EP 管置于转速为12 000 r·min-1的4 ℃离心机中离心15 min。离心后取出EP 管，再将EP 管中的上清液转移至空的EP 管中，向新的管中加入600 μL 异丙醇，轻轻摇晃，摇晃后静置12 min。静置结束，将EP管离心15 min，转速为12 000 r·min-1。离心后取出EP 管，将管中的上清液舍弃，向管中加入由DEPC 水配制的75%乙醇溶液600 μL，静置5 min。静置后将EP 管4 ℃离心5 min，转速为7 500 r·min-1。离心结束，取出EP 管，将上清液舍弃，继续12 000 r·min-1离心1 min。弃取上清液，将其余液体吹干，去除酒精，加入20 μL DPEC 水进行溶解，溶解后静置15 min，放入-80 ℃冰箱中保存。

RNA 提取完毕后，加入DEPC 水2 μL、Specific Primer（特异性下游引物）2 μL、Random Primer 1 μL、提取好的RNA 模板1 μL。PCR 条件为70 ℃10 min，共1 个循环。再向上述PCR 管中加入混合液：5×MMLV Buffer 2 μL、dNTP mix（10 mM）0.5 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、M-MLV 1 μL、DEPC 水1 μL，PCR反应过程为30 ℃保温10 min，42 ℃保温60 min，70 ℃保温15 min，共1 个循环。得到含PEDV 全基因组的cDNA 溶液。

以得到的cDNA 为模板，加入模板1 μL、上游引物0.2 μL、下游引物0.2 μL、Buffer 3 μL、dNTP 2 μL、酶0.13 μL、ddH2O 13.47 μL，总反应体系为20 μL。Nsp7 基因扩增反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，57.1 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25 个循环；72 ℃保温7 min。将所得到的PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，利用胶回收试剂盒对目的产物胶回收，在-20 ℃冰箱中保存。

1.5 Nsp7 基因真核表达载体的构建及鉴定

将pCMV-Myc 载体使用EcoRⅠ与XhoⅠ进行双酶切，酶切条件为37 ℃、2 h，然后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后利用Omega 胶回收试剂盒将目的条带进行胶回收。将切下的DNA 胶用700 μL Binding Buffer 溶解，条件为60 ℃、10 min。将溶解后的混合液倒入吸附柱中，转速12 000 r·min-1离心1 min，重复该步骤一遍。离心结束后弃掉下管液体，向上管中加入300 μL Binding Buffer，继续12 000 r·min-1离心1 min。弃下管液体，加入700 μL Wash Buffer于上管中，转速12 000 r·min-1离心1 min，此过程重复1 次。丢弃下管液体，13 700 r·min-1离空2 min。离心后向上管加入30 μL 已经加热到60 ℃左右的去离子水，静止溶解5 min，13 700 r·min-1离心2 min，得到纯化后的基因片段和载体片段。

准备PCR 管，放入两种纯化后的产物，同时加入无缝克隆酶2×Seamless、Buffer 和去离子水，总体系为10 μL，放入水浴锅中，连接温度为50 ℃，连接时间为15 min。产物转化DH5α，平板涂布，培养箱培养10 h。挑取单菌落，在液体LB 培养基中37 ℃摇床培养10～12 h 后，将菌液进行PCR 鉴定。PCR 结果显示，扩增出的条带与目的基因大小相符，随后用质粒提取试剂盒提取质粒，并将提取后的质粒进行双酶切鉴定。将鉴定成功的样品送至公司进行测序，将测序结果与理论序列进行比对，结果证明重组质粒正确构建，可做后续实验，将正确质粒命名为pCMVMyc-Nsp7。

1.6 Western Blot 检测

待IPEC-J2 细胞、HEK-293T 细胞密度为80%时，开始转染。首先将质粒在13 000 r·min-1转速下离心10 min，达到除菌的目的。将细胞板中原有的培养基换成DMEM 培养基，放在细胞培养箱备用。将质粒取出，根据质粒的浓度计算加到24 孔细胞培养板中的体积。转染空载体pCMV-Myc 质粒和pCMVMyc-Nsp7 质粒各800 ng，并设置空白对照。准备两个EP 管，管1 中加入50 μL DMEM 和800 ng 质粒溶液。管2 中加入50 μL DMEM 和1 μL 脂质体。静置5 min 后，将两管液体混合，再静置20 min。静置结束后，将混合液分别加入到24 孔板的细胞培养液中，放入37 ℃培养箱中，转染4～6 h，换成500 μL 10%胎牛血清的DMEM 培养基。置于5% CO2培养箱中，37 ℃培养24 h，收取样品。样品收集：将转染后的细胞培养板放置于冰盒上，弃掉培养液，用500 μL的PBS 洗涤2 次，在细胞板每孔中加入40 μL 的RIPA 裂解液，将细胞板放置于4 ℃裂解30 min，裂解工作完成后，将每孔中被裂解的细胞从细胞板上刮下，分别加入到1.5 mL 离心管中，在4 ℃离心机中12 000 r·min-1离心10 min，吸取上清，弃沉淀。加入10 μL 的5×Loading Buffer，最后把蛋白质和染料煮沸10 min，使得蛋白完全发生变性，可直接进行电泳。跑胶：配置聚丙烯酰胺凝胶，等待胶凝固以后，组装胶和电泳槽，在确定不漏的情况下倒入1×SDS电泳液，插上电极，分离蛋白样品，将蛋白样品煮沸10 min，12 000 r·min-1离心10 min。吸取10 μL 上层样品点样，设置电压80 V，跑完上层胶，再把电压改为120 V，当目标蛋白完全分离后，关闭电源。转膜：将胶板撬开，按照条带大小切下对应胶条，切下的凝胶和滤纸放到转膜液中，打开转膜仪，底层铺入浸泡过转膜液的垫网，然后铺上浸泡过的三层滤纸，在滤纸上淋加转移液，驱赶滤纸下层气泡。用镊子将PVDF 膜平铺在滤纸上，采用先中间再两边的铺放办法，避免气泡的产生（膜要提前进行切角做标记，以记住反正面），然后将胶轻轻的铺放在PVDF 膜上，用手调整，使胶各边缘与膜平齐，用玻璃棒赶出多余气泡。再铺一层滤纸及垫网，将转膜夹合紧，放在转膜槽中，将转膜槽放入冰浴的转膜盒中电压200 V、电流100 mA，2 h 后将胶体取出（可以看到转移到膜上的Marker）。封闭：将PVDF 膜放入0.5%的脱脂奶粉中，在摇床上封闭孵育2 h。封闭结束后，需要用1×TBST 溶液洗膜4 次，每次洗膜5 min。孵育抗体：按照说明书配置一抗和二抗，将PVDF 膜先后置于配置好的一抗和二抗中孵育，一抗孵育时间为2 h，1×TBST溶液洗膜2 h，洗膜时间为每次15 min；二抗孵育2 h，1×TBST 溶液洗膜2 h，洗膜时间为每次15 min。曝光：用AI600 仪器曝光，保存结果图片。

1.7 间接免疫荧光

在细胞板中放入爬片，接种细胞，待细胞密度达到60%左右时，开始转染，用Lipofectin2000 将pCMV-Myc 和pCMV-Myc-Nsp7 质粒转染至IPECJ2、HEK-293T 细胞中，4～6 h 后更换含有10%胎牛血清的DMEM 500 μL。在37 ℃、5% CO2培养24 h，取出细胞培养板，弃掉培养液，PBS 洗2 次；向24 孔细胞培养板中每孔加入500 μL 的4%多聚甲醛溶液，10 min 后弃掉溶液，加入PBS 清洗3 次，每次15 min，均放置于水平摇床上；弃掉PBS，加入500 μL的0.1%曲拉通溶液，静置20 min，增加细胞膜的通透性；将曲拉通吸弃，用PBS 洗3 次，每次15 min。每孔加入500 μL 的5% BSA 溶液，静置2 h 后加入PBS，摇床清洗细胞板，每次15 min，清洗3 次；然后用1%BSA 溶液稀释特异性抗体，每孔加入500 μL，静置孵育2 h，加入PBS 清洗细胞板；再加FITC 荧光标记的二抗，室温避光孵育2 h。回收二抗稀释液，加入PBS，将细胞板放在摇床上清洗3 次，每次15 min，最后制片。制片操作如下：首先用镊子取出干净的载玻片，向载玻片上滴加少量DAPI 封片剂，然后挑出细胞爬片，放在封片剂中央，用干净的纸巾轻轻压在细胞爬片上，吸干多余的封片剂，避光放置30 min。待晾干后，黑暗条件下用激光显微镜观察细胞的情况，最后拍照并保存。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR 扩增Nsp7 基因全长序列

从病变猪小肠提取总RNA，反转录出cDNA，利用设计的特异性Nsp7 的上、下游引物，并以cDNA为模板对目的基因进行PCR 扩增，所得目的条带为252 bp 的PEDV Nsp7 基因片段，结果如图1 所示。

图1 Nsp7 基因片段的PCR 扩增Fig.1 PCR amplification of Nsp7 gene fragment

2.2 真核表达载体pCMV-Myc 双酶切

为构建PEDV Nsp7 基因的真核表达载体，试验将利用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ两种限制性内切酶对pCMV-Myc 载体进双酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，显示真核表达载体双酶切成功，结果如图2 所示。

图2 pCMV-Myc 载体的双酶切Fig.2 Digestion of pCMV-Myc vector

2.3 重组质粒pCMV-Myc-Nsp7 的鉴定

利用无缝克隆酶2×Seamless 将目的基因和载体的酶切产物进行连接，连接产物用感受态DH5α 转化，过夜培养，挑取单菌落扩大培养，37 ℃摇床10～12 h，对其进行菌液PCR 鉴定，琼脂糖凝胶电泳后在250 bp 附近出现明亮单一的条带，结果如图3 所示。菌液鉴定成功后，提取质粒，进行双酶切鉴定。酶切体系：EcoRⅠ1 μL、XhoⅠ1 μL、10×H Buffer 1 μL、质粒2 μL、去离子水5 μL，总体系10 μL，置于37 ℃水浴锅中2 h。双酶切产物电泳后在3 000 bp 和250 bp附近出现两条条带，得到试验条带与预期理论设计结果相符，结果如图4 所示。结果均显示重组质粒构建成功，将其命名为pCMV-Myc-Nsp7。

图3 重组质粒pCMV-Myc-Nsp7 的菌液PCR 鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pCMV-Myc-Nsp7 by PCR

图4 重组质粒pCMV-Myc-Nsp7 的双酶切鉴定Fig.4 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pCMV-Myc-Nsp7

2.4 重组质粒pCMV-Myc-Nsp7 的测序及其序列分析

为比较构建的重组质粒与原始Nsp7 基因序列的同源性，将筛选的阳性重组质粒pCMV-Myc-Nsp7取10 μL 送至生物公司进行测序。将NCBI 网站上的PEDV Nsp7 基因序列与所得到的测序结果进行序列比对，最终结果显示，其同源性高达99%，重组质粒构建成功。序列比对结果如图5 所示。

图5 pCMV-Myc-Nsp7 与CV777 毒株Nsp7 基因序列比对Fig.5 Sequence alignment between pCMV-Myc-Nsp7 and CV777 strain Nsp7

2.5 重组质粒的Western Blot 鉴定

为检测重组质粒pCMV-Myc-Nsp7 在细胞中的表达情况，将重组质粒分别转染至HEK-293T 细胞、IPEC-J2 细胞中，先后利用鼠抗Myc 单抗及山羊抗小鼠荧光二抗标记，检测空载体pCMV-Myc 及重组表达载体pCMV-Myc-Nsp7 的表达情况。Western Blot 结果显示，重组质粒pCMV-Myc-Nsp7 在IPEC-J2 细胞、HEK-293T 细胞均能够成功表达，结果如图6 表示。

图6 Western Blot 鉴定蛋白融合表达Fig.6 Identification of fusion protein expression by Western Blot

2.6 重组蛋白Nsp7 的免疫荧光鉴定

研究以间接免疫荧光技术探究了pCMV-Myc-Nsp7 在IPEC-J2 细胞和HEK-293T 细胞中的分布情况。免疫荧光结果显示，重组表达载体pCMVMyc-Nsp7 质粒在IPEC-J2 细胞和HEK-293T 细胞中成功表达，结果如图7 所示。

图7 重组蛋白Nsp7 在细胞中表达的免疫荧光鉴定Fig.7 Immunofluorescence identification of recombinant protein Nsp7 expression in cells

3 讨论

猪肠道冠状病毒（SECoV）包括猪流行性腹泻病毒（PEDV），传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪δ 型冠状病毒（PDCoV），占新生猪致命性水样腹泻的大部分，并给世界带来重大的经济和公共卫生负担。冠状病毒感染的共同特征是逆转宿主细胞周期，以促进病毒复制，但具体机制在很大程度上仍未知。虽然这三种SECoV 主要感染体内肠上皮，并引起相似的临床体征，但其细胞向性和致病性存在明显差异[12]。PEDV 最初在20 世纪70 年代报道，导致新生仔猪死亡率最高。主要表现为呕吐、腹泻、厌食、消瘦，年龄越小，症状则越为明显，对养殖业以及畜牧业造成巨大的威胁。该病在英国被首次发现，与猪胃肠炎病症状极为相似，给猪进行诊断和治疗带来了极大的困难[13-14]。而两者主要区别是猪流行性腹泻主要针对于幼猪，对幼猪威胁较大，对成年猪而言，症状较轻，不致死[15-16]。自猪流行性腹泻在欧洲多个国家爆发以来，使得农场中猪的产量直线下降，造成了非常大的影响[17]。在PEDV 流行期间，不同的出版物引用了与PEDV 快速传播相关的几个风险因素（动物运动，卡车污染，屠宰场污染，受污染的饲料和饲料厂，以及农场员工等），控制PEDV 感染最有效的途径之一是接种疫苗[18]。

猪流行性腹泻病毒核酸型为RNA，编码的5 种结构蛋白为S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白、N 蛋白、ORF3蛋白，其中ORF3 蛋白是其唯一编码的辅助性蛋白。该病毒还编码非结构蛋白，即Nsp1-Nsp16。这些非结构蛋白在病毒复制、装配、拮抗天然宿主免疫中发挥重要的作用。现在关于PEDV 编码的各种蛋白的表达及生物学功能研究的文献相对较少。有研究表明，CoV 的Nsp7 蛋白是相对保守的，由于蛋白构象的缘故，发挥功能时可能受到Nsp8 的影响，或是与Nsp8相互作用[17]。但在PEDV 中，Nsp7 抑制干扰素的产生，与Nsp8 无关[19]。猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的Nsp7 在病毒组装过程中发挥重要作用，其定位在细胞质，下调猪小肠上皮细胞中IL-8 的表达[20]。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的Nsp7 在诱导宿主体液免疫应答中起重要作用[21]。在SARS-CoV-2 中，Nsp7、Nsp8 和Nsp12 为RNA 转录复合物（RTC）的三个组分，负责识别和处理RNA，用于新病毒的繁殖和病毒蛋白的核糖体转录[22]。

Nsp7 在病毒生命周期中发挥重要作用，由于与已知结构的同源性非常低，导致对Nsp7 的功能和结构机制知之甚少。为探讨Nsp7 蛋白功能，研究利用基因克隆技术构建了pCMV-Myc-Nsp7 真核表达载体，并验证Nsp7 蛋白在细胞中能正常表达，为猪流行性腹泻病毒Nsp7 蛋白的功能研究奠定了良好的基础。