肿瘤相关巨噬细胞两种不同亚型在结肠癌中的作用

李静娴 何 靖 佀亚兰 李 岩

1 山东第一医科大学第一附属医院(山东省千佛山医院) 肿瘤学 山东省风湿免疫病转化医学重点实验室山东省肺癌研究所,山东省济南市 250000; 2 郓城诚信医院肿瘤科

根据国际癌症研究机构(IARC)的数据,到2020年,全球约有190万个结直肠癌新病例和94万个结直肠癌死亡病例[1]。在如此庞大的病例数据的支持下,研究者发现,结肠癌中的肿瘤相关巨噬细胞并不全预示较差的预后,有时甚至可以限制原发性肿瘤的生长和转移,为患者带来更好的预后和治疗效果。关于肿瘤相关巨噬细胞在结肠癌中发挥的作用目前尚无详细且统一的确切研究,甚至很多实验结果都是相互矛盾。

笔者在阅读了大量临床资料后发现,以上这些研究所体现出的不同预后价值,主要是因为肿瘤相关巨噬细胞其本身的异质性——两种不同的肿瘤相关巨噬细胞亚型,即经典激活的M1亚型和交替激活M2亚型。肿瘤微环境中的巨噬细胞并不是单一亚型的聚集,往往都是M1和M2亚型巨噬细胞的混合物。目前人们普遍认为M1亚型的促炎和抗肿瘤效应功能(M1偏斜)更加有利于患者的预后;而M2亚型的免疫抑制和促愈合特性(M2偏斜)则会对结肠癌患者预后产生不利作用[2]。在肿瘤发展的不同阶段,两种亚型之间是可以通过一些免疫反应介质进行转换来逆转免疫和炎症反应[3]。

因此明确肿瘤相关巨噬细胞两种亚型在结肠癌中的具体作用,可为后续肿瘤学的研究发展提供更有力的参考价值。所以,本文探索了肿瘤相关巨噬细胞的代谢方式、标记物、在肿瘤中发生的作用、影响因素、临床治疗等方面,全面分析了M1亚型和M2亚型的不同之处。

1 肿瘤相关巨噬细胞两种亚型不同的代谢方式适应不同的功能需求

1.1 M1型巨噬细胞的代谢方式 主要是由于糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸合成和戊糖磷酸盐通路的产生。其中,糖酵解是M1亚型获取能量的主要方式,被经典激活的炎性M1巨噬细胞通过 AKT/mTOR/HIF诱导途径所诱导。虽然糖酵解的方式效率低、葡萄糖消耗高,但其可快速产生能量用于生物合成的特性,非常有利于M1巨噬细胞及时防御病原体的功能。同时产生的琥珀酸、一氧化氮 (NO)、乳酸和活性氧(ROS)等也能抵御细菌和肿瘤细胞的侵袭。

1.2 M2型巨噬细胞的代谢方式 M2巨噬细胞则是通过激活脂肪酸氧化和增加氧化磷酸化、减少糖酵解等方式进行代谢。首先为M2提供能量的则是氧化磷酸化偶联的氧化TCA循环。脂肪细胞中储存的游离脂肪酸被激活的M2型巨噬细胞获取、利用后,以甘油三酯的形式促进脂肪酸的合成。而在M1代谢过程中起主要作用的有氧糖酵解,在M2代谢中反而被抑制以产生细胞因子。

2 可识别肿瘤相关巨噬细胞的标记物

目前评判肿瘤相关巨噬细胞的预后相关性指标主要依赖一些泛巨噬细胞标志物,比如CD68等。然而作为泛标志物,它可以同时标记M1和M2两种亚型的肿瘤相关巨噬细胞,被CD68标记的肿瘤相关巨噬细胞也被称为泛肿瘤相关巨噬细胞。即使同为CD68阳性巨噬细胞,肿瘤内的巨噬细胞预示着更差的预后,而在肿瘤浸润前沿(ITF)的巨噬细胞则预示着更好的生存率。这无法体现出肿瘤相关巨噬细胞的异质性,以这些指标预测预后必定会得到截然相反的结果[4]。因此在临床实践与实验分析中应充分了解标志物,仔细谨慎对待使用CD68等泛标记物获得的数据,排除掉泛标记物的影响,从而获取最准确的信息。

2.1 M1型巨噬细胞的标记物 M1型巨噬细胞在抗原呈递、淋巴细胞共刺激和杀伤的过程中,产生的标记物标志是CD68、CD80、CD83、iNOS、HLA-DR、CD40和iNOS等。周围健康黏膜组织内巨噬细胞CD80的表达较肿瘤内的表达更高,从而使得肿瘤内巨噬细胞表现出免疫抑制作用。而在Ⅲ期肿瘤中,肿瘤浸润前沿高 CD80/CD163比值则预示着更好的临床预后。

2.2 M2型巨噬细胞的标记物 而M2巨噬细胞的标志是CD68、IL-10、CD163、CCL17、Arg1、MRC1、CCL22、CD206和CD204[5]。在巨噬细胞被极化时,M2型细胞亚型的标志物是CD163。CD163阳性的CD68+巨噬细胞占比为40%,而NOS2阳性的CD68+巨噬细胞占比为60%。所以,可以推测出,CD68对肿瘤的积极作用主要是由占比为60%的NOS2+巨噬细胞——M1型巨噬细胞产生的。几乎40%的肿瘤相关巨噬细胞都可以表达CD163。通过分析CD68+/iNOS阴性肿瘤相关巨噬细胞的结肠癌患者的临床数据,发现表达CD163+和CD68+肿瘤相关巨噬细胞的M2型巨噬细胞的肿瘤间质中的肿瘤坏死因子往往提示着更短的无病生存期(DFS)和总生存率(OS)。因此CD163往往预示着结肠癌患者较差的预后。

3 肿瘤相关巨噬细胞不同亚型在结肠癌中产生不同的作用

肿瘤相关巨噬细胞和结肠癌的关系紧密相连。首先,肿瘤相关巨噬细胞本身就是大多数炎症细胞聚集的部位。其次,为了维持和调节肠道内环境的稳定,肠道内存在体内最大数量、最丰富的巨噬细胞。一旦受损就会导致肠道炎症的出现。而这种持续的局部炎症状态就有利于肿瘤的产生。因此,揭示肿瘤相关巨噬细胞在结肠癌中的具体作用可以达到更加精准的临床治疗及推测预后。

3.1 M1型在肿瘤初始阶段的抑制作用 M1型的巨噬细胞最初往往可以抑制肿瘤的生长。M1巨噬细胞在肿瘤发展过程中的主要作用在于促进Th1型免疫反应、表达高水平的促炎细胞因子、表达高活性氮和氧中间体和杀伤肿瘤活性等。例如,M1型细胞的极化可以刺激Th1细胞反应,对肿瘤和微生物发挥杀伤力。可以诱导抗肿瘤反应的高表达的促炎细胞因子主要有:肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-23 (IL-23)和活性氧(ROS)[6]。另外,即使在低氧或者肿瘤细胞因子缺乏的环境下,M1型巨噬细胞仍然可以对肿瘤起到杀伤作用。

3.2 M2型对肿瘤发展的促进作用 M2型的巨噬细胞常常表现出预后不良和肿瘤免疫抑制的效果。 在一项针对81名中国结直肠癌患者的IHC研究中,侵袭前基质中CD163的高表达与较短的肿瘤分级、淋巴管侵袭、肿瘤侵袭、淋巴结转移、TNM分期和无复发生存率显著相关。CD163+(M2偏斜)巨噬细胞的密度越高,患者的预后越差[7]。在两个连续的独立队列的病理Ⅱ期结直肠癌患者中,M2偏向的巨噬细胞数量较多,CD206+/CD68+比例较高,与复发频率较高和总生存期较短有关[8]。M2型巨噬细胞也可能表明患者的肿瘤低分化、淋巴结转移和肝转移程度。

M2型巨噬细胞可促进组织和肿瘤的生长、高清除分子同时提供有效吞噬的作用,从而影响肿瘤微环境中免疫细胞的作用。M2型巨噬细胞的作用则是通过促进血管和上皮—间质转化(EMT)的形成,为肿瘤提供营养,增强肿瘤细胞迁移和侵袭,参与组织建模和修复、调节性T细胞的分化并抑制抗肿瘤免疫等方式实现。可以产生的分子包括IL-6、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子-β(TGF-β)[9]。 其中,已知TGF-b通过miR-34a/VEGF轴促进肿瘤的生长和侵袭。

4 影响肿瘤相关巨噬细胞向不同亚型复极的因素。

4.1 促进M1型极化的生物因素 细菌产物(LPS)、干扰素γ(IFN-γ)、TNF-α、脂多糖(LPS)、Th1细胞因子(IFNγ)和toll样受体激动剂可以极化激活M1,从而产生促炎、细胞毒性和呈递抗原的作用。在单核细胞表面可以通过信号转导和转录激活因子(STAT)1信号通路来产生M1型细胞。诱导M1型极化不仅有助于炎症反应,而且在抗肿瘤免疫反应中也发挥着重要作用。

有学者指出,p50基因消除后IL-23表达的下调已被证明可增强M1/Th1免疫反应,这也是肠道内肿瘤多样性和生长明显减少的原因之一[10]。对PGE2受体EP4进行药理抑制可增加抗肿瘤的M1型巨噬细胞的数量,抑制结肠中肿瘤的形成。

4.2 影响M2型的生物因素

4.2.1 促进M2型极化的生物因素:从细胞周围环境来看,肿瘤微环境能对肿瘤相关巨噬细胞的异质性产生影响,促进其从促炎的M1型复极为抗肿瘤的M2型。首先,癌细胞本身可以招募骨髓来源的血液单核细胞,改变其代谢以促进M2型的极化。同时,结肠癌细胞还可以激活EGFR/PI3K/AKT/mTOR途径分泌表皮生长因子来诱导M2的极化;结肠癌细胞CT116和HT29可以调节M2型巨噬细胞的表达,并使M2型更具侵袭性,例如通过增加波形蛋白表达和降低E-钙蛋白水平。此外,正常结肠上皮细胞如果缺失SLC7A2的表达,也可以促进促炎细胞因子/趋化因子(IL-1β)、C-X-C基序配体1、2和5(CXCL1、CXCL2和CXCL5)、IL-3和CC-趋化因子配体3和4(CCL3和CCL4)的表达,从而刺激M2型的极化。

其次,一些白细胞介素除了可以帮助肿瘤免疫逃逸、增强其免疫抑制外,还能刺激肿瘤血管生成,促进肿瘤细胞生长、转移和侵袭。其中,单核细胞表面的受体IL-4R可以和IL-4通过Jnaus激酶1(JAK1)和Jnaus激酶3(JAK3)促进STAT6的激活和移位,从而促进M2型的极化。除了上述的IL-4和IL-13之外,糖皮质激素可以诱导M2型巨噬细胞分泌部分抗炎细胞因子,如IL-10和IL-1β。TGF-β、CCL18均可以诱导促进M2型的极化,CCL18可能与炎症消退过程中出现的第二波趋化因子和细胞浸润有关,它也可以参与正反馈回路以维持患者体内的抗炎表型。肥胖的结肠癌患者体内IL-6的表达较非肥胖的结肠癌患者增高,这可以诱导CCL20的分泌,从而通过趋化作用招募表达CCR6的B细胞和γδT细胞,促进结肠癌的进展。

血管内皮生长因子一方面可以聚集肿瘤微环境中的髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞和调节性T细胞(Tregs)等免疫抑制细胞,另一方面可以驱动Tregs,降低CD8+T细胞中IFN-γ的分泌,促进M2型的活性表达。同时,M2型的类肿瘤坏死因子可以反过来产生大量的血管内皮生长因子,在肿瘤内形成一个免疫增强的逆向循环。

还有一些可以影响M2型的细菌,如产气荚膜梭菌,它通过激活IL-6/STAT3/c-MYC信号有助于调节肿瘤免疫逃避,并被肿瘤相关的中性粒细胞、MDSC细胞和M2型巨噬细胞选择性地招募。此外,前列腺素也可能有助于M2型极化。 例如,发挥重要作用的前列腺素E2,在组织炎症条件下可通过花生四烯酸诱导环氧化酶-2(COX-2)的产生,促进M2型巨噬细胞的极化[11]。

许多外泌体都对M2型的极化产生重要作用。首先,M2型巨噬细胞本身所分泌的外泌体miR-155-5p、miR-21-5p可以分别通过影响IL-6稳定性、与结肠癌细胞编码序列结合从而下调BRG1的表达来加速结肠癌的发生进展和转移[12]。其次,在体外,M2型巨噬细胞的数量可以被结肠肿瘤球分泌的外体miR-1246提高;CAF分泌的含GM-CSF和IL-6的外泌体可以使单核细胞分化成M2型巨噬细胞,使M2巨噬细胞被激活从而促进结肠癌细胞的新生血管形成和血管生成,有利于肿瘤的转移[13]。此外,几个携带来自CRC细胞的miRNA的外泌体(miR-130b-3p、miR-25-3p和miR-425-5p)通过PI3K/Akt信号促进M2极化以调节PTEN基因所表达的蛋白,而肿瘤相关巨噬细胞也可以促进EMT和VEGF的产生。携带miRNA-106b-5p的外泌体也可以促进M2型极化并诱导CRC细胞的EMT,这可能与肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞之间的串扰有关。

4.2.2 抑制M2型极化的生物因素:在小鼠实验中有学者观察到,在隔日禁食的小鼠中,它们结肠癌细胞的生长速度会更慢一点,同时体重也没有出现明显下降。这与细胞外腺苷生成的减少和JAK1/STAT3途径的失活有关,它们共同导致了M2型极化的抑制。这个实验说明干预饮食是可以通过影响肿瘤相关巨噬细胞极化活性来影响肿瘤的发生发展。众所周知,结肠癌肿瘤外源性因素包括饱和脂肪酸、精制碳水化合物、精加工肉类具有促炎特性的食物。这些食物和少量运动力量还可以导致肥胖—另一重要外源性因素。因此对于高危人群来说,控制饮食(减少促炎特性食物的摄入)对于预防癌症来说有着积极作用。

5 有关肿瘤相关巨噬细胞的临床肿瘤治疗

由于M2型极化对肿瘤的促进作用和M1型极化对肿瘤的抑制作用,人工促进M2型肿瘤相关巨噬细胞向M1 型肿瘤相关巨噬细胞极化对确保肿瘤细胞的退化至关重要。目前,临床上抑制肿瘤进展的治疗思路也是刺激M1型的极化和抑制M2型的极化。然而,晚期肿瘤倾向于使大多数巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。再加上实际的肿瘤微环境中M2型巨噬细胞的数量远远高于M1型巨噬细胞的数量,这些都使得肿瘤细胞的退化变得极为复杂。通过巧妙运用两种亚型的不同特点和影响因素之间的关系,相当一部分药物已经取得了一定的成效。

5.1 促进M1型极化的临床治疗 首先,在基因水平层面,塞来昔布通过增加ApcMin/+小鼠息肉中M1型相关基因(iNOS, CXCL10)的mRNA水平。其次,干扰M1、M2型极化的途径及物质表达也可以产生相应的抗肿瘤作用。西妥昔单抗诱导结直肠癌中的M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-12和TNF-α的表达。CCR5抑制剂可以通过STAT3/SOCS3途径促进结肠癌患者体内的M1极化,从而抑制肿瘤的进展。他喹莫德影响早期肿瘤浸润的骨髓细胞,诱导血管生成和表型变化,从而将肿瘤相关巨噬细胞转变为炎症性M1型。T2核糖核酸酶、多激酶抑制剂瑞戈非尼在平衡肿瘤中巨噬细胞的M1/M2型比例和招募适应性抗肿瘤CD8+T细胞方面都起着关键作用。

5.2 抑制M2型极化的临床治疗 一些临床研究表明,非甾体抗炎药(NSAIDs)可以通过抑制前列腺素E2,从而促进p50 NF-κB的激活和M2型的极化。抗CD40抗体也可以阻断NK-κB途径来抑制巨噬细胞M2免疫活性。多激酶抑制剂瑞戈非尼、达沙替尼可以抑制肿瘤相关巨噬细胞的M2极化[14]。 厄洛替尼则通过抑制EGFR相关的细胞内酪氨酸激酶的磷酸化来减少肿瘤相关巨噬细胞[15]。此外,一些血管内皮生长因子抑制剂如IL-33可溶性异构体sST2(ST2)等通过阻断上文所述的血管内皮生长因子和M2型之间的反馈通路,使肿瘤免疫微环境正常化,从而抑制M2型极化。在使用IBC治疗的基础上,添加益生菌可以减少免疫抑制性调节性T细胞和M2型巨噬细胞的浸润,改善免疫浸润。

正如上文所述,肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤的作用,主要是通过改变细胞外基质重塑、肿瘤代谢、血管生成以及肿瘤微环境等来促进肿瘤发展。虽然对肿瘤发展起到一定作用,但是两种不同亚型的肿瘤相关巨噬细胞作用却大相径庭,因此本文总结分类两种亚型在代谢方式、标记物、在肿瘤中发生的作用、影响因素、临床治疗等方面对于未来选择肿瘤预后标志物、进行相关肿瘤相关巨噬细胞实验研究和治疗结肠癌都是非常有价值的。

在肿瘤相关巨噬细胞的研究中发现,部分泛标志物的使用不仅会导致实验结果可信度的降低,同时也会为后续的研究增添不必要的困惑。对于所获得的大量相互矛盾的实验和临床数据,笔者认为应该更仔细谨慎对待并详细分析其出现的可能性。在研究结肠癌的进展当中,肿瘤相关巨噬细胞起到了主导地位,根据肿瘤微环境中产生的具体生物信号而改变,两种不同亚型可以使其在肿瘤发展的不同阶段起到完全相反的作用。如M1亚型具有促炎、抗肿瘤等作用,M2亚型可以抗炎、促进肿瘤发展。这两种亚型的肿瘤相关巨噬细胞主要是通过分泌一些趋化因子和细胞因子来影响肿瘤生长、浸润和免疫抑制的过程。目前临床开发的一些抑制肿瘤进展的治疗药物,其治疗思路主要就是刺激M1亚型的极化(增加M1巨噬细胞的数量和占比)和抑制M2亚型的偏斜极化激活(减少体内M2巨噬细胞的数量和占比)来改善患者病情,提高患者预后效果。

总之,分辨TAMs不同亚型在结肠癌中的作用对于未来选择肿瘤预后标志物、进行相关TAMs实验研究和结肠癌治疗的临床实践都是非常有价值的。相信在不久的将来,会有更有效地促进M1型极化的药物出现,应用于临床。肿瘤研究人员都应该为此努力,并就肿瘤相关巨噬细胞的作用方式与治疗应用进行更为深入的讨论和探索。