黑牛肝菌多糖提取工艺比较及其体外抗氧化活性研究

王俊杰，牛 蓓，2，时小东，胡凯丹，徐 莺

（1.成都大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610106；2.成都大学 基础医学院，四川 成都 610106；3.四川大学生命科学学院，四川 成都 610065）

0 引言

黑牛肝菌（Boletus aereus Fr.ex Bull），牛肝菌属大型可食用真菌，在我国主要分布于云南、四川、贵州等地区［1］。其子实体“低脂、低热、高蛋白”，富含多种矿物质元素以及人体必需氨基酸，是一种食药两用的野生真菌［2－6］。当前，黑牛肝菌多数以鲜品或干品的形式直接售卖，功能挖掘和产品开发工作缺乏，导致相关产业经济效益较低，寻找并开发其中的生物活性物质是提升黑牛肝菌附加值，促进产业开发和利用的途径之一［3］。

多糖是属于黑牛肝菌的重要生物活性成分之一，其具有降糖、降脂、抗氧化、增强机体免疫功能等出色的保健功效［1］。黑牛肝菌多糖高效提取方法的建立是其开发利用的前提。已报道的方法有超声辅助萃取、水提醇沉法等［7］，但关于超声辅助复合酶法提取黑牛肝菌多糖的报道未见描述。本研究开展3 种提取黑牛肝菌多糖方法效率的比较研究，并采用单因素试验结合响应面法优化超声辅助复合酶提取法条件，最后采用不同的方法测试所获得的不同醇沉组分多糖的体外抗氧化活性，以期为黑牛肝菌多糖资源产业化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜黑牛肝菌子实体样品购自云南省西双版纳州景洪市牛夫人鲜黑牛肝菌栽培基地，洗净除杂后，50℃烘干打粉，过60 目筛后备用。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖提取单因素优化实验

热水提取法。精确称取黑牛肝菌子实体干粉5 g于锥形瓶中，以料液比（1 ∶ 20、1 ∶ 40、1 ∶ 60、1∶ 80、1∶ 100 g／mL）与蒸馏水混合后进行水浴（50、60、70、80、90℃），水浴时间为（1、2、3、4、5 h）。5 000 r／min离心10 min 并过滤后收集上清。保持条件不变复提2 次，第2 次和第3 次所用溶剂体积均为第1 次的50%。合并上清，真空浓缩至原体积的1／4 左右，加入无水乙醇至终浓度为80%。4℃静置过夜后离心（6 000r／min，10min），沉淀复溶于水后加入1／5 体积的Sevage 试剂（氯仿∶正丁醇＝4∶ 1），剧烈震荡30min 后离心，除去中间变形蛋白层和下层有机试剂层，重复该过程直至蛋白层稀薄为止。将获得的上清液在3 500Da透析袋中透析48h后，冷冻干燥，获得黑牛肝菌多糖。

超声提取法。精确称取黑牛肝菌子实体干粉5 g于锥形瓶中，以料液比（1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1∶ 50、1∶ 60g／mL）和蒸馏水混合后水浴，水浴初始设定温度为30℃，在不同水浴功率（200、240、280、320、360 W）和不同超声时间（10、20、30、40、50 min）的条件下进行处理。其余步骤同1.2.1.1 热水提取法。

超声辅助复合酶提取法。精确称取黑牛肝菌子实体干粉5 g 于锥形瓶中，加入不同浓度（1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%）的复合酶溶液（纤维素酶：木瓜蛋白酶＝2∶ 1），在不同酶解温度（30、40、50、60、70℃）、酶解时间（30、60、90、120、150 min）和超声时间（10、20、30、40、50 min）下进行单因素实验，之后在100℃水浴锅中加热10 min灭活。其余步骤与热水提取法相同。

1.2.2 响应面优化实验

选择黑牛肝菌多糖最终得率最高的提取方法，选择酶添加量、处理温度和时间为自变量，以提取率为响应值，依据Box－Behnken原理进行设计进行行因素三水平的响应面优化实验，结果如表1 所示。

表1 响应面实验因素与水平Table 1 Response surface factors and levels

1.2.3 多糖分级醇沉组分的制备

向超声辅助复合酶提取法获得的提取上清液中缓慢添加无水乙醇至乙醇体积比达到20%，4 ℃静置12 h，离心（5 000 r／min，15 min），沉淀经冷冻干燥后得到20%醇沉多糖组分BAP－20。在上清液中继续添加无水乙醇至体积比为40%、60%、80%，重复以上操作，得到40%醇沉多糖组分BAP－40、60%醇沉多糖BAP－60 和80%醇沉多糖BAP－80。

1.2.4 多糖测定

依照钟方晓等报道的苯酚—硫酸法［8］进行多糖含量测定。取2.0mL 不同浓度葡萄糖溶液和1.0mL6%苯酚、5.0mL浓硫酸摇匀静置，30min后测量490nm吸光值绘制标准曲线。然后将经同样处理的多糖样品的光吸收值代入标准曲线换算出多糖浓度。

1.2.5 抗氧化活性测定

DPPH自由基清除能力测定。参考王宏亮等报道的方法［9］进行。吸取不同浓度的多糖溶液1 mL与2 mL 的含1 mmol／L DPPH 的乙醇溶液充分混匀，黑暗下静置30 min，离心10 min 取上清液测量520 nm处吸光值（A1）。相同浓度的Vc溶液为正对照。无水乙醇为样品对照组（A2）、纯水为空白对照组（A0）。DPPH自由基清除率的计算公式如下：

羟自由基清除能力测定。参考Zhang 等方法［10］进行。吸取不同浓度的多糖溶液1 mL 与1 mL ABTS工作液混匀，黑暗下静置6 min后测量734 nm 处吸光值。以相同浓度的Vc 溶液为正对照。ABTS自由基清除率的计算公式如下：

式中：A1为样品组吸光值；A2为对照组吸光值；A0为空白对照组吸光值。

还原力测定。参照马丽媛等研究所提出的铁氰化钾还原法［11］并略作改动。取0.5 mL多糖溶液加入10 mL具塞试管中，与2.5 mL0.2 mol／L 磷酸缓冲液（pH 6.6）混匀，加入铁氰化钾溶液至终浓度为1%，于 50℃水 浴 20 min 后 与 2.5 mL10%CCl3COOH溶液混匀，3 000 r／min 离心10 min。取2.5 mL上清液、0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液和2.5 mL蒸馏水混匀，充分反应10 min 后，于700 nm 处测定吸光值［12］。

1.2.6 数据与统计方法

所有试验均重复3 次，获得数据使用Excel 2010、SPSS Statistics 24、Origin 2022 以及方差分析（ANOVA）进行处理和显著性分析。响应面试验采用Design－Expert 12 进行数据处理和分析。

2 结果及分析

2.1 三种黑牛肝菌多糖提取方法的单因素实验

2.1.1 热水提取法的单因素实验

采用热水提取法测定不同液料比、提取时间和温度参数下黑牛肝菌多糖的提取率（图1A）。当固定提取温度和液料比为70℃和1：60g／mL 时，多糖得率随提取时间增加而逐渐升高，在4h 时达到最高。但当提取时间增至5 h 时后，多糖得率反而略有下降，这可能是因为水浴时间过长，导致部分多糖发生水解所致［13］。将提取时间和液料比设定为4h和1：60g／mL 时，测试的提取温度范围从50℃到90℃，多糖得率同样表现为先升高后下降，最佳温度为70℃。设定提取温度和时间分别为70℃和4h，液料比在1：20g／mL到1∶ 100g／mL范围内变化，当料液比为1∶ 80 g／mL时得率最高。

图1 单因素试验结果Figure 1 Single－factor experiments

综上可得，热水提取法提取黑牛肝菌多糖的最佳条件为：水浴时间4 h，水浴温度70 ℃，料液比为1∶ 80 g／mL。

2.1.2 超声提取法的单因素实验

采用超声提取法测定不同料液比、超声时间和功率参数对黑牛肝菌多糖提取效率的影响（图1B）。在料液比为1∶ 40g／mL、超声功率为280W 的条件下，超声时间为20 min 时得率最高，之后随着时间增加得率逐渐降低。这可能是因为超声会促使多糖从组织中溶出，但随着超声时间延长会导致多糖的降解，提取率降低［14］。在超声时间为20min，超声功率为280W 的条件下，料液比为1∶ 30 g／mL 时，多糖得率达到6.74%。但当料液比继续增加后，多糖得率反而呈下降趋势。这可能是由于增大溶剂量虽然可以使溶出更充分，而溶剂量过大会影响后续的浓缩沉淀工艺，导致得率降低［15］。在超声时间为20min、料液比为1∶ 30g／mL时，多糖得率随超声功率的增加呈现出先上升后下降的趋势，在280 W时达到最高。这可能是由于超声功率过小使得系统接收的能量小，分子运动速度相对偏慢，破碎效率低，而过大的功率又会影响多糖结构，从而导致得率变低所致［16］。

综上可得，超声提取法提取黑牛肝菌的最佳条件为：超声时间20 min，超声功率280W，料液比为1∶ 30g／mL。

2.1.3 超声辅助复合酶提取法的单因素实验

采用超声辅助复合酶提取法测定不同酶添加量、酶解时间和温度、超声时间对多糖得率的影响（图1C）。在酶解温度为50℃、酶添加量为2.50%、超声时间为30min的条件下，在30—60 min 的时间内，多糖提取率呈上升趋势，60—150 min 则呈下降趋势。这可能是因为在酶量充足的情况下，随着酶解时间的增加，不仅底物被不断消耗，溶出的黑牛肝菌多糖也会被酶水解而减少所致［11］。在酶解时间为60min、酶添加量为2.50%、超声时间为30min的条件下，随着酶解温度的不断升高，多糖得率呈现出先上升再下降的趋势，在40℃时达到最高。出现这种趋势是由于温度太低或太高都会影响酶的活性，导致其分解速率下降，从而影响多糖得率。在酶解时间为60min、酶解温度为40℃、超声时间为30min的条件下，多糖得率在酶添加量从1.5 %到2.00%呈现快速上升趋势，达到最高点，然后随着酶添加量的继续增加开始缓慢下降。出现该趋势可能是当酶的添加量偏低时，底物充分，得率由酶的数量驱动，而当酶添加量高于2.0 0%时，由于酶分子处于饱和状态，反应变为底物驱动型，在底物浓度不变的情况下，底物水解速度不再增加，同时未参与纤维素降解的酶以多糖为底物将之水解，进而影响多糖含量［17］。在酶添加量为2.00%、酶解时间60min、温度为40℃的条件下，超声时间对提取率的影响为先上升再下降，最佳超声时间为20 min。

综上可得，超声辅助复合酶提取的最佳条件为：酶解时间60 min，酶解温度40℃，酶添加量2.00%，超声时间20 min。

2.2 响应面试验

根据单因素优化实验结果，超声辅助复合酶提取法的得率最高。选择该方法中对多糖得率影响较大的3 个因素（酶解温度、酶添加量和酶解时间）为变量，以多糖得率为响应值，采用Box－Behnken 组合设计法设计，开展包括12 个析因点及5 个中心点组成的共17 组实验，具体实验设计及结果如表2 所示，方差分析结果如表3 所示。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments

表3 方差分析结果Table 3 Results of ANOVA analysis

利用Design－Expert软件对表2 中的数据进行拟合，得到多糖提取率的多元二次回归模型：Y ＝18.33 ＋0.2875A－0.125B ＋0.8025C－0.4750AB ＋0.6AC－0.225BC－1.61A2－0.802B2－1.68C2。

由表3 可知，超声辅助复合酶提取法的多糖得率回归模型的p值小于0.000 1，达到极显著水平，说明模型拟合精度良好，可用于后续提取工艺的优化设计。失拟项p ＝0.507 1 ＞0.05，模型总决定系数R2＝0.998 4，adj＿R2＝0.996 4，说明模型拟合优度较好，试验误差小，可用于响应值的预测［18－20］。

根据响应面的陡峭程度、等高线形状分析各因素变化对多糖得率的影响以及因素间交互作用的强弱及影响作用的大小［20］结果如图2 所示。由图2可知，酶添加量、酶解时间和温度3 个因素两两之间的交互作用对黑牛肝菌多糖提取率的影响都非常显著，并且该结果与回归分析保持一致。当固定酶解时间时，酶解温度曲线的陡峭程度大于酶添加量的曲线，表明酶解温度对实验结果的影响大于酶添加量（图2A）。在固定酶添加量时，响应曲面图开口向下，两个方向的响应面均呈现出先上升后下降的陡峭变化曲线，即酶解温度和酶解时间的增加对多糖得率的影响都是先促进后抑制，这与单因素结果保持一致（图2B）。从图2C 可见，当固定酶解温度时，酶添加量和水浴时间对多糖得率的影响均是先增加再降低的趋势。

图2 因素间交互作用对黑牛肝菌多糖提取的影响Figure 2 Influence of response surface plots of variable parameters on the B.aereus polysaccharide yield

综上，优化结果为：酶解温度42.7 ℃，酶解时间67 min，酶添加量为1.92 %，超声时间为20 min。此方案下的预期黑牛肝菌多糖得率为18.867%。

2.3 黑牛肝菌多糖的体外抗氧化活性研究

对获取的黑牛肝菌多糖水溶液进行逐级醇沉，获得不同分子量的4 种组分：BAP20、BAP40、BAP60和BAP80，4 种组分的多糖含量分别为86.01%、69.55%、75.95%、65.61%。以Vc 为对照，分别采用DPPH、ABTS、羟自由基清除能力和还原力测定4种方法测定4 种组分的体外抗氧化活性，结果如图3 所示。

图3 黑牛肝菌多糖的体外抗氧化活性Figure 3 The in vitro antioxidant activity of B.aereus polysaccharides

结果显示，各醇沉组分均展示出了剂量依赖性的抗氧化能力，其中BAP－80 的各项抗氧化活性均最高。当浓度为5mg／mL 时，对DPPH 自由基的清除率达到68.03%，在此浓度下的维生素C 清除率为72.37%，两者无显著性差异（p ＞0.05）；ABTS自由基清除率为94.65%，同浓度维生素C 清除率为89.83%，黑牛肝菌多糖对于ABTS 自由基的清除能力略高于维生素C；羟自由基清除率为62.85%，同等浓度的维生素C 清除率达到85.62%，黑牛肝菌多糖的羟自由基清除能力远低于维生素C。黑牛肝菌多糖同样具有良好的还原能力，BAP－80 依然为最高活性组分。分析不同醇沉组分的组内关系，基本呈现出醇沉浓度越高，得到的多糖组分抗氧化活性越高的趋势。

3 讨论

高得率的多糖提取方法是黑牛肝菌多糖开发利用的前提，本研究发现超声辅助复合酶提取法的多糖得率远高于其它两种方法，通过响应面法优化后的平均得率为18.47%，并且获得的黑牛肝菌多糖表现出良好的体外抗氧化活性，说明黑牛肝菌多糖具有深度开发的潜力。

在黑牛肝菌多糖提取中，热水提取法的得率在5%左右，提取时间在4h 左右［21］，超声辅助提取法的得率约为 10%，提取时间仅需 30min 左右［12，22－24］。两相比较可以看出后者不仅在得率上达到提高，在时间效率方面也有很大优势，可以降低提取能耗。超声辅助复合酶提取法则在保持超声辅助提取法的优势上，进一步将多糖得率提高了80%，这无疑会大大降低原料成本。从原理上来说，真菌的多糖组要存在于其细胞壁，后者包括纤维素、壳多糖、蛋白质以及其他次生代谢产物。超声处理和酶解处理都能促进细胞壁的破碎，释放出其中的多糖分子。不仅如此，超声还可形成微流，使溶剂更易进入，使得酶与细胞壁接触更充分。有文献研究表明纤维素酶对纤维素的可及性是制约酶解效率的重要参数，贡献度达到90%以上［26］，因此超声和酶解共同处理的效果不是单纯的数量相加关系。

抗氧化活性是多糖的主要生物活性之一。影响多糖抗氧化活性高低的因素很多，如分子量、糖基组成、链结构等，一般而言，高分子量、复杂的多糖结构可能表现出更强的抗氧化活性。然而有意思的是，本研究中分子量最低的BAP—80 组分体外抗氧化活性表现最为突出。已有文献报道云南大理黑牛肝菌同样在醇沉浓度为80%时得到的多糖提取物抗氧化活性最强［7］。考虑到BAP—80 组分的多糖含量在4 种组分中最低，因此不能排除其中可能含有其他成分如多酚、糖醛酸、蛋白类物质参与了氧化还原反应［27－29］，因此在后续的研究中非常有必要开展进一步的纯化工作。