全外显子组测序诊断Rothmund-Thomson综合征的临床研究

王晓玲,郭若兰,王江涛,郭 俊,陈元颖,郝婵娟

1.郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院小婴儿病房,河南郑州 450000;2.北京市儿科研究所出生缺陷遗传学研究北京市重点实验室/国家儿童医学中心遗传与出生缺陷防治中心/儿科重大疾病研究教育部重点实验室/首都医科大学附属北京儿童医院,北京100045

Rothmund-Thomson综合征(RTS)是一种少见的常染色体隐性遗传病,1868年由德国眼科医生Rothmund 首次报道,后由英国皮肤科医生Thomson 等相继描述。RTS主要临床表现为皮肤异色症,毛发稀疏,腹泻,骨骼发育异常或畸形,指甲营养不良或牙齿异常,矮小,青少年白内障,早衰,高肿瘤风险等[1]。目前研究认为该病发生与 RECQL4基因(OMIM:603780;NM_004260.3)突变有关,人类基因突变数据库(HGMD)已收录该基因致病或可能致病变异141个,包括错义突变、无义突变、剪接位点突变、小的插入/缺失突变等多种变异类型。本研究通过高通量测序对河南省儿童医院小婴儿病房收治的1例先天多发畸形患儿进行一家三口全外显子组测序,基因结果提示该患儿携带2个RECQL4基因新突变,分别来自父母双方,最终确诊为RTS。现将该病例报道如下,以提高对该病的认识,并丰富RECQL4基因突变谱。

1 临床资料

1.1一般资料 患儿,女,3月24 d,以“腹泻3月余,咳嗽10 d”为代主诉入院;患儿生后数天即出现腹泻,呈黄色稀糊状便,≥10次/天,量少。体质量增长差,先后在当地医院及诊所治疗,间断口服肠道益生菌、蒙脱石散等治疗(具体用药及剂量不详),患儿腹泻无好转。10 d前患儿出现咳嗽,呈阵发性连声咳,3～5声/次,≥10次/天,有痰不易咳出,无发热、喘息、呼吸困难等,病初在家自行口服金振口服液、氨溴特罗口服液等治疗3 d,效果差,后至当地医院住院治疗,诊断为“支气管肺炎”,治疗6 d,给予哌拉西林/他唑巴坦、氨溴索等药物输注(具体用药剂量不详),患儿咳嗽无明显好转,遂转至河南省儿童医院就诊。门诊以“支气管肺炎”收入院。发病来,患儿精神反应一般,食欲欠佳,大便稀,≥10次/天,小便量减少。患儿系孕40周+1生产,出生体质量2 kg,出生后人工喂养,出生后因低出生体质量、四肢畸形在当地新生儿科住院治疗1周,好转出院。

入院查体:体质量3.2 kg,身长56 cm,神志清楚,精神反应差,营养不良貌,皮下脂肪菲薄,毛发稀疏,面色苍白,颜面部、臀部可见较多片状色素减退斑,双下肢可见2处咖啡牛奶斑,头颅无畸形,头围36 cm,前囟平软,直径0.8 cm×0.8 cm,口唇稍苍白,口腔黏膜光滑,无高腭弓,颈软,胸廓对称无畸形,三凹征阴性,双肺呼吸音粗,可闻及粗湿啰音,心音有力,HR 140次/分,律齐,心前区可闻及2/6级柔和收缩期杂音,腹软,肝脾肋下未触及,未扪及包块,肠鸣音正常,四肢末梢暖,双手拇指关节缺如,仅有皮瓣与手掌相连,双手其余四肢及双足趾关节无明显畸形,四肢肌张力低,腱反射未引出,不会竖头,追视追听未引出。 见图1～5。

图1 患儿就诊时颜面部色素脱失斑

图2 患儿就诊时臀部色素脱失斑

图3 1月后随访时患儿颜面部皮疹改变

图4 1月后随访时患儿臀部皮疹改变

图5 患儿手指发育畸形

入院检查:血尿粪常规、生化全套、甲状腺功能5项、血氨、血气分析、血尿遗传代谢检查均未见明显异常。痰培养显示:大肠埃希菌。心脏彩超显示:卵圆孔未闭,轻度肺动脉高压;腹部彩超未见异常。四肢X线片未见关节脱位及骨骼发育异常。

1.2基因检测方法 经患儿父母知情同意和河南省儿童医院伦理委员会批准,使用EDTA抗凝真空管采集患儿及其父母外周血各2 mL,利用天根生化科技有限公司血液基因组DNA提取试剂盒(DP348)进行基因组DNA提取。对患儿及父母基因组DNA,利用Agilent SureSelect人外显子组V6捕获试剂盒构建文库,使用Illumina Nova 6000测序平台进行2×150 bp双端测序。测序数据经质量控制、冗余数据过滤、基因组参考序列比对等,得到患儿及父母全外显子组的SNV及Indel等突变。应用千人基因组数据库(1 000 Genomes)、ExAC、gnomAD等人群数据库过滤等位基因人群频率大于5‰的突变,应用多个在线预测软件(MutationTaster、SIFT、Polyphen-2、NNSPLICE等)预测基因突变的有害性,查阅ClinVar、HGMD数据库以及PubMed中相关文献报道,并依据美国遗传学会(ACMG)2015年发布的致病变异分级指南[2],综合判断突变致病性。

1.3测序结果 一家三口全外显子组高通量测序结果提示,患儿携带RECQL4基因复合杂合突变:c.3237-2A>T和c.1593_1594delTC,分别遗传自患儿父亲和母亲,并且通过一代测序进行了验证(图6)。

图6 一代测序验证结果

笔者查阅dbSNP数据库、千人基因组数据库、ExAC数据库以及gnomAD数据库,未发现以上2个突变的人群频率报道,提示均为罕见变异。检索HGMD、Clinvar数据库以及PubMed,未见到2个突变的致病病例报道,鉴定为RECQL4基因的2个新突变。根据美国遗传学会(ACMG)2015年发布的致病变异分级指南,c.3237-2A>T和c.1593_1594delTC突变均满足PVS1、PM2、PP3的致病性证据,评级为致病变异。综合患儿临床表型及RECQL4基因结果,确诊为RTS。

2 文献复习

分别以Rothmund-Thomson综合征、RECQL4基因、Rothmund-Thomson syndrome、RECQL4为检索词,在中国知网、万方数据库、PubMed数据库进行中英文文献检索(检索时间从建库至2023年8月)。共检索到中文文献10篇,英文文献131篇,目前共报道RTS病例 400余例[3]。

2.1成因 约60%的RTS是由RECQL4突变导致,10%的RTS是由ANAPC1 突变导致[4];通过分子遗传学检测,到目前为止RTS分为2种临床亚型:RTS-Ⅰ型是不常见的亚型(35%～40%),与ANAPC1 基因突变相关[5],临床特征包括皮肤异色症、外胚层发育不良和青少年白内障。RTS-Ⅱ型较常见(60%～65%),是由于RECQL4基因复合杂合突变或纯合突变导致。其临床特征为皮肤异色症、先天性骨缺损和高肿瘤风险[6-7]。

2.2诊断 RTS的诊断取决于临床表现和(或)双等位基因的致病变异。RTS 被认为是一种累及多系统的遗传性皮肤病,高达90%的患者皮肤损害表现为面部红斑、水肿以及脸颊上的水疱,在出生后的最初几个月可能会延伸至耳郭、前额、颈部和四肢。随着患儿的生长,皮肤异色症的特征性病变(毛细血管扩张、萎缩、色素沉着过度或色素沉着不足的斑块)会出现,并持续存在;30%的病例可能会出现掌跖角化过度,30%的病例会出现头发和指甲的异常,主要表现为头发细、头发稀疏、局部脱发、指甲营养不良或无甲。其他症状包括身材矮小、骨骼畸形、牙齿发育不全、性腺功能减退、白内障、缺损或圆锥角膜[8]。对于临床表现提示为RTS的患者应尽早进行分子诊断。

2.3高肿瘤风险 RECQL4基因突变会导致基因组不稳定,增加恶性肿瘤风险。SIMON等[9]提出,RECQL4截短突变的患者发生癌症的风险较高。骨肉瘤的患病率约为30%,皮肤癌(鳞状细胞癌)的患病率约为5%,其他肿瘤包括恶性纤维组织细胞瘤、基底细胞癌、鲍文氏病、骨髓增生异常、急性髓系白血病[10]。

3 讨 论

RTS多在 3～6个月发病,典型的临床表现为皮肤异色症,皮肤异色多开始于面部,逐渐发展至四肢、臀部[11]。婴儿期可出现胃肠道症状,包括长期呕吐腹泻,生长落后,毛发稀疏,牙齿萌出延迟或龋齿,指甲营养不良,骨骼发育障碍(表现为桡骨缺失或发育不良、拇指缺失等)。约 40%患者4～7岁时发生白内障,晶状体浑浊伴角膜变性;部分患者智力发育正常或低下,性腺发育不良或功能低下[12]。骨肉瘤或其他恶性肿瘤的发病率明显增高[13]。本例患儿发病早,主要表现为面部、臀部皮肤异色症样改变,腹泻,拇指畸形,生长发育迟滞,毛发稀疏。随访1月后皮肤异色症加重,呈大理石样外观,生长发育明显落后于同龄儿,乳牙未萌出;尚未出现白内障,骨肉瘤及其他恶性肿瘤等,后期需长期随访。

RTS 与Baller-Gerold综合征(BGS)和Rapadilino综合征在临床表型上有重叠现象[14]。BGS是一种罕见的伴有桡骨发育不全和颅缝早闭的常染色体隐性遗传病(OMIM 218600),其临床表现为颅缝早闭,桡骨缺损,生长迟滞[15]。Rapadilino综合征是一种罕见的常染色体隐性遗传综合征,其命名来源于主要临床特征的首字母缩略词,包括桡骨发育不良或缺如、髌骨缺如、腭裂或高腭弓、腹泻、关节脱臼、身材矮小、肢体畸形、鼻子细长,智力正常,发病者多为芬兰人[16]。RTS与Rapadilino综合征鉴别点为皮肤异色症;具有特征性的皮肤异色症可被认为是RTS的特殊表现[17]。RTS与BGS的鉴别点为后者存在颅缝早闭[18]。但RECQL4基因突变可出现在这3种疾病中,因此,以上综合征中的基因型与表型之间的相关性需要进一步研究。

RECQL4基因定位在常染色体8q24.3,有21个外显子,编码包含1 208个氨基酸的RECQL4蛋白,属于RECQ DNA解旋酶家族成员,其功能为在DNA复制和修复过程中解开DNA双链。RECQL4基因在保持DNA稳定及DNA代谢等多个方面有重要作用[19]。 在过去几年积累的证据表明,RECQL4不仅在癌症发生、发展中起关键作用而且在早衰过程中也发挥重要作用[20]。

研究表明,RECQL4基因突变是大多数RTS病例的发病原因。本例患儿RECQL4基因携带2个杂合突变:c.3237-2A>T和c.1593_1594delTC,分别来自其父亲和母亲,为复合杂合突变,符合常染色体隐性遗传规律。 c.3237-2A>T为剪接位点变异,位于19号外显子5′端上游-2位,是经典的剪接受体位点。通过NNSPLICE 0.9 version(http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)、Human Splicing Finder 3.1(http://www.umd.be/HSF/HSF.shtml)等在线软件预测,该位置突变可导致剪接受体位点丧失,发生剪接异常。c.1593_1594delTC位于9号外显子,为小的缺失突变,可引起基因的编码阅读框发生框移突变。该突变位置序列在多个物种间高度保守,可导致编码氨基酸第533位由亮氨酸突变为丙氨酸,并在突变第6位提前出现终止密码子。基因突变后的产物RNA预计会通过“无义介导的mRNA衰减”机制降解或产生截短蛋白,从而导致等位基因的活性大部分丧失。同时,通过公共数据库与已发表文献的检索,本病例报道的2个突变均为之前未报道的新突变,丰富了RECQL4基因的突变谱。

4 面临的问题

从首次描述这种疾病至今 100 多年间,大约在60%的RTS患者中观察到RECQL4基因突变,10%的RTS 患者存在ANAPC1突变,因此约30%的患者仍未确诊致病基因,新 RTS 致病基因的鉴定在近些年停滞不前。另外,RTS患者的RECQL4基因突变具有罹患恶性肿瘤的高风险,早期发现肿瘤对患者预后及预期寿命有重要影响。由于这种疾病的罕见性,目前尚未为 RTS-Ⅱ型患者制定规范的癌症监测方案。

5 展 望

随着测序技术的发展,与RTS相关的新的基因将会被鉴定。而基因型与表型的差异,不同基因变异如何导致相似的临床表现,RTS相关基因背后是否存在共同机制?这些问题是进一步研究这种复杂疾病背后的分子和病理生理机制的方向。

综上所述,RTS综合征是以皮肤异色症为主要表现、并累及多个系统的罕见遗传病,部分患者有白内障、脱发、骨质减少等早衰表现及肿瘤易感性[13],生存期目前尚缺乏相关数据。RECQL4基因突变检测有助于确诊本病,基因型与表型之间的关联性仍需进一步研究。