miR-421和miR-196b-3p在胃癌癌前病变和早期胃癌诊断中的潜在价值*

王文怡,余静恬,甘 程

武汉科技大学附属天佑医院检验科,湖北武汉 430000

胃癌是全球主要癌症之一[1]。由于缺乏肿瘤标志物和特定的症状和体征,通常在诊断时已经转移[2]。研究表明,晚期胃癌患者的预后较差,5年生存率低于25%[3]。然而,如果在癌前病变或早期阶段进行干预和治疗,5年生存率将上升至85%以上[4]。因此,寻找可靠且非侵入性的生物标志物用于胃癌的早期检测和大规模筛查具有重要的临床意义。微小RNA(miRNA)是不编码蛋白质的18～25个碱基的RNA。由于它们的稳定性和可重复性较高,已经成为某些癌症最具潜力的生物标志物之一[5]。胃癌和各种miRNA之间的联系已在大量研究中被证实[6-7]。然而,关于胃癌癌前病变中miRNA的表达尚未得到充分验证,也缺乏微阵列进行全面分析的报告。本研究使用血液标本进行了微阵列试验,重点筛查在慢性萎缩性胃炎(胃癌癌前病变)和早期胃癌患者中特征性表达的miRNA,并分析不同miRNA在胃癌癌前病变和早期胃癌诊断中的价值和意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究经本院医学伦理委员会批准(201810-017)。(1)发现集:于2018年12月1日至12月31日采集早期胃癌患者3例(早期胃癌组)的血浆标本,另外按照年龄和性别相匹配原则,签署知情同意书后,招募3例胃癌癌前病变患者(癌前病变组)和3例健康志愿者(NC组),采集血浆标本用作miRNA微阵列分析。(2)验证集:于2019年1月1日至2023年1月1日共采集90例胃癌患者(胃癌组)、89例癌前病变患者(癌前病变组)的血浆标本。所有患者都接受了胃肠镜检查或其他检查(包括消化内镜、计算机断层扫描或内镜超声检查),并经活检标本的病理检查证实为癌前病变或胃癌。癌前病变组包括低度上皮内瘤变51例和中度上皮内瘤变38例。另外,根据国际癌症控制联盟(UICC)肿瘤-淋巴结转移(TNM)系统第8版[8]确定胃癌分型和分期:Ⅰ期16例,Ⅱ期19例,Ⅲ期31例和Ⅳ期24例。早期胃癌是指局限于胃黏膜层或黏膜下层的癌组织,不论其范围大小或是否有淋巴结转移,即TNMⅠ/Ⅱ期。接受手术、放疗或化疗的患者被排除在本研究之外。另外按照2∶1和年龄、性别相匹配的原则纳入45例健康志愿者(NC组)。所有符合条件的受试者都同意参与本研究,并获得了有关年龄和性别的信息。将采集用于体检的血液标本残留(约2 mL)用于miRNA分析。

1.2方法

1.2.1血浆制备和储存 立即使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集每个参与者静脉血4 mL,2 h内以3 000 r/min离心5 min,防止细胞核酸污染。将转移到无RNase/DNase试管中的上层血浆储存在-80 ℃直至分析。分离用于常规肿瘤标志物测定的血浆样品,保存在-20 ℃直至测定。

1.2.3来自公共数据库的癌症组织的miRNA表达数据 使用TCGA癌症数据集(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/),比较了95例正常胃黏膜组织和441例胃癌组织中miRNA的表达。并从Broad研究所开发的Firehose软件中获得了基因和miRNA的单核苷酸多态性(SNP)阵列数据。使用ASCAT算法和R软件3.3.2版从SNP阵列数据计算miRNA的拷贝数。

1.2.4验证集中提取miRNA和qRT-PCR检测 使用血液(血清/血浆)miRNA提取和纯化试剂盒(离心柱,上海诺伦生物医药技术有限公司)从200 μL血浆中分离miRNA。使用NanoQ微量分光光度计(博奥生物集团有限公司)定量血浆miRNA水平。qRT-PCR的初始模板为2 μL。使用一步法Stemaim-it miR qRT-PCR试剂盒定量(Taqman探针,上海诺伦生物医药技术有限公司)测定循环miRNA表达,而miR-16作为参考miRNA。在ABI-7500 PCR系统上检测靶miRNA水平,并使用SDS 2.0软件(美国应用生物系统)通过循环阈值(Ct)值计算。Ct值大于32的样品被排除在外。miRNA水平用2-ΔΔCt方法标准化。

1.2.5验证集常规肿瘤标志物检测 根据罗氏公司试剂盒和罗氏E170全自动免疫分析仪的标准程序,通过电化学发光免疫测定法对常规肿瘤标志物铁蛋白、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA211、CA50、CA125、CA199、CA153、CA242、CA724进行检测。

1.3统计学处理 所有数据均使用SPSS26.0和GraphPad Prism 7.0进行分析。非正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示,多组间比较采用Kruskal-WallisH检验,多组间两两比较采用Mann-WhitneyU检验。绘制受试者工作特征(ROC)曲线评估每种肿瘤标志物的诊断价值。最佳截断值使用最大约登指数确定。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1发现集miRNA微阵列分析结果 对发现集血浆标本进行了miRNA微阵列分析,在P<0.05和q<0.2条件下的分析结果显示,分别有44个、136个和45个miRNA在NC组和癌前病变组、NC组和早期胃癌组、癌前病变组和早期胃癌组间表现出差异表达(P<0.05)。其中,与NC组相比,miR-421[早期胃癌组:2.55(2.03,3.19),癌前病变组:1.67(1.14,2.45),NC组:0.42(0.39,0.55)]和miR-196b-3p[早期胃癌组:2.39(1.99,2.97),癌前病变组:1.65(1.16,2.18),NC组:0.83(0.70,0.98)]在早期胃癌组和癌前病变组明显上调(P<0.05),且早期胃癌组miR-421和miR-196b-3p较癌前病变组上调更明显(P<0.05)。进一步利用TCGA数据库对组织标本中miRNA的表达进行了比较分析。结果显示,miR-421在胃癌组织中呈高表达[0.098(0.072,0.146)],与在正常胃黏膜的表达[0.002(0.001,0.003)]相比,差异有统计学意义(P<0.001)。然而,miR-196b-3p表达在胃癌组织和正常胃黏膜之间比较[0.011 0(0.000 1,0.047 0)vs.0.009 0(0.000 1,0.042 0)],差异无统计学意义(P=0.079)。

2.2验证集miR-421、miR-196b-3p和常规肿瘤标志物水平 在验证集中,与NC组相比,癌前病变组和胃癌组血浆miR-421、miR-196b-3p水平明显上调(P<0.05),且胃癌组血浆miR-421、miR-196b-3p水平高于癌前病变组(P<0.001)。此外,胃癌组CEA、CA125、CA211和CA50水平均明显高于NC组和癌前病变组(P<0.05),CA199和CA724水平高于NC组(P<0.05)。癌前病变组血浆miR-421、miR-196b-3p、AFP、铁蛋白、CA211、CA50水平明显高于NC组(P<0.05)。见表1。

表1 验证集NC组、癌前病变组和胃癌组血浆中miR-421、miR-196b-3p和常规肿瘤标志物水平比较[M(P25,P75)]

2.3miR-421、miR-196b-3p和肿瘤生物标志物对胃癌的诊断价值 将验证集中NC组和癌前病变组作为对照,根据ROC曲线评估,血浆miR-421对胃癌的诊断准确性最高,AUC为0.931(95%CI:0.889～0.972)。进一步将miR-421、miR-196b-3p与传统肿瘤标志物的诊断价值进行比较。结果显示miR-421的AUC高于CEA、CA125、CA199、CA724、CA211、CA50诊断胃癌的AUC(P<0.05),同样miR-196b-3p诊断胃癌的AUC也高于CEA、CA125、CA199、CA724诊断胃癌的AUC(P<0.05)。另外,miR-421的假阴性率也低于所有常规肿瘤生物标志物。见表2和图1。

注:以NC组和癌前病变组作为对照。

表2 miR-421、miR-196b-3p和肿瘤标志物对胃癌的诊断价值

2.4血浆miR-421、miR-196b-3p对早期胃癌的诊断价值 进一步分析血浆miR-421、miR-196b-3p在早期(TNMⅠ期16例和Ⅱ期19例)胃癌患者中的诊断价值,将NC组和癌前病变组作为对照组。早期胃癌组血浆miR-421水平[3.50(2.19,5.22)]高于对照组[ 0.95(0.76,1.18)],差异有统计学意义(Z=6.751,P<0.001);早期胃癌组血浆miR-196b-3p[1.88(1.16,2.73)]水平高于对照组[0.97(0.75,1.24)],差异有统计学意义(Z=4.723,P<0.001)。将NC组和癌前病变组作为对照,绘制ROC曲线分析血浆miR-421、miR-196b-3p对早期胃癌的诊断价值。结果显示:miR-421诊断早期胃癌的AUC为0.942(95%CI:0.886～0.997),灵敏度为88.61%,特异度为93.36%;miR-196b-3p诊断早期胃癌的AUC为0.809(95%CI:0.708～0.910),灵敏度为68.62%,特异度为86.75%。见图2。

注:以NC组和癌前病变组作为对照。

2.5miR-421、miR-196b-3p和肿瘤生物标志物对癌前病变的诊断价值 将NC组作为对照,根据表1结果绘制ROC曲线,血浆miR-421或miR-196b-3p水平上调可以很好地区分癌前病变患者和NC组。血浆miR-421和miR-196b-3p诊断癌前病变的AUC分别为0.788和0.648,miR-421的AUC均高于miR-196b-3p、铁蛋白、CA50诊断癌前病变的AUC(P<0.05),但是略低于CA211(P<0.05)。见表3和图3。

注:以NC组为对照。

表3 miR-421、miR-196b-3p和肿瘤标志物对癌前病变的诊断价值

2.6验证集胃癌组不同分期、癌前病变组及NC组miR-421和miR-196b-3p水平比较 验证集癌前病变组与胃癌组TNM Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ/Ⅳ期之间miR-421、miR-196b-3p水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。然而,胃癌Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期病例之间血浆miR-421和miR-196b-3p水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 验证集胃癌组不同分期、癌前病变组及NC组miR-421和miR-196b-3p水平比较[M(P25,P75)]

3 讨 论

迄今为止,还没有可靠的无创性血液生物标志物用于诊断早期胃癌或癌前病变[9]。本研究首先通过微阵列筛选,确定了癌前病变和早期胃癌患者血浆miR-421和miR-196b-3p存在差异表达。进一步通过临床血浆标本证实了这两种miRNA对于癌前病变和胃癌患者有良好的诊断价值:早期胃癌和癌前病变患者血浆miR-421、miR-196b-3p水平明显高于NC组; ROC曲线分析结果显示,miR-421和miR-196b-3p在区分早期胃癌或癌前病变患者与NC组方面具有很高准确性。因此本研究结果表明,血浆miR-421和miR-196b-3p在诊断早期胃癌和癌前病变患者方面可能是有临床意义的生物标志物。

miR-421定位在人类染色体1p34.23上,是 miR-200 家族的重要成员之一[10]。据KIM等[11]报道,胃癌组织和胃液中miR-421水平的升高可能对胃癌诊断有意义。这些结果与本研究的发现一致,即miR-421在胃癌患者中高表达,可能在胃癌中具有潜在的诊断价值。miR-196基因家族(miR-196a-1、miR-196a-2、miR-196b)是从人类同源盒(HOX)基因簇区域中含有3个基因(ECRG4、RAD23B和HOXA10)的区域转录而来[12]。miR-196a-1和miR-196a-2具有相同的成熟核苷酸序列,但成熟miR-196b与成熟miR-196a仅相差1个核苷酸[13]。在先前的研究中,miR-196b的大量表达抑制了ECRG4和RAD23B[14]。此外,HOXA10和miR-196b同时过表达的胃癌患者预后较差[15]。因此,miR-196b和HOXA10的过度表达可能介导因幽门螺杆菌引发慢性炎症所导致的癌症进展。但是目前关于miR-196b-3p在胃癌发病和进展中的临床证据不足。在本研究中,miR-421和miR-196b-3p在区分胃癌患者与NC组及癌前病变组方面可以达到令人满意的诊断效能,AUC分别为 0.931和0.804,尤其是miR-421,其AUC高于所有的常规肿瘤生物标志物,同样miR-196b-3p的AUC也高于CEA、CA125、CA199和CA724。总之,上述数据进一步阐明了这两种miRNA作为新型肿瘤标志物的诊断价值。

提高胃癌的早期诊断率对于及时治疗尤为重要。既往,研究人员已经阐明了几种miRNA在早期胃癌诊断中的潜在作用[16-18]。尽管诸如miR-101之类的研究对胃癌的早期阶段具有很高的诊断价值,但该研究不包括癌前病变,并且miRNA的细微变化和性能没有进一步阐述。在本研究中,基于胃癌标本的详细TNM分期特征,笔者探讨了血浆miR-421和miR-196b-3p在早期胃癌中的诊断价值,结果表明,miR-421和miR-196b-3p都能较好地区分早期胃癌与对照组(NC组+癌前病变组),提示miR-421和miR-196b-3p在早期胃癌诊断中可能具有显著的临床价值。

癌前病变会使患胃癌的风险增加6倍以上[19]。以前的研究报道称癌前病变受miRNA调节[20]。由于缺乏胃肠化生和非典型增生的临床表现,临床缺乏有效的无创检测手段。几种循环miRNA,特别是miR-196a、miR-18a、miR-21、miR-125b等,已被筛选出作为胃癌和癌前病变以及胃癌进展的早期标志物[21-22]。然而,这些miRNA与传统肿瘤标志物在胃癌和癌前病变诊断中的比较价值尚未明确。最佳循环miRNA生物标志物应比传统肿瘤生物标志物具有更好的特异度和灵敏度。在本研究中发现血浆miR-421和miR-196b-3p可以很好地区分癌前病变和NC组,AUC分别为0.788和0.648。尤其是miR-421的诊断效能明显高于一些传统的肿瘤生物标志物,如铁蛋白和CA50。

胃癌的发生和发展是一个多阶段的过程,miR-421、miR-196b-3p可能与某个阶段或整个疾病过程有关[22]。本研究最后进一步分析了miRNA随胃癌进展上调的趋势。结果表明,血浆miR-421和miR-196b-3p水平在胃癌Ⅰ期病例中的表达与Ⅱ、Ⅲ/Ⅳ期无差异,但在发病早期(Ⅰ～Ⅱ期),已经能够有效地区分胃癌和癌前病变,表明miR-421和miR-196b-3p上调最初是发生在癌前病变和早期胃癌中的。因此,本研究推测这两种miRNA的上调可能是由致癌危险因素引发的,例如癌前慢性炎症或幽门螺杆菌感染,但这需要进行详细的调查。

综上所述,本研究结果表明,血浆miR-421和miR-196b-3p可能是癌前病变和早期胃癌的潜在标志物。这项研究为临床提供了关于这两种miRNA在胃癌发病中作用的新见解。这些结果可能为开发用于早期胃癌诊断的新型生物标志物铺平道路。这项研究的局限性在于样本量相对较小,为单中心研究,缺少多因素分析等。总之,miR-421和miR-196b-3p作为早期血浆生物标志物在癌前病变和胃癌临床诊断中的确切用途应在使用较大样本量的研究和临床试验中进一步探索。