建立LC-MS/MS检测血清中5种脂溶性维生素的方法及临床验证*

于 鹏,周传贵,楚士颖,李 艳,2,迟 伟,田 晗,程文播,2△

1.天津国科医疗科技发展有限公司,天津 300399;2.中国科学院苏州生物医学工程技术研究所,江苏苏州 215163;3.辽宁省沈阳市妇幼保健院,辽宁沈阳 110014

脂溶性维生素是人体保持最佳新陈代谢状态所必需的微量营养素,主要包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K 4种[1]。随着研究的深入,脂溶性维生素的作用早已不局限于人们的初步认识,比如夜盲症[维生素A(VA)缺乏]、骨软化症(维生素D缺乏)、氧化应激异常[维生素E(VE)缺乏]和异常出血(维生素K缺乏)等,而是发现脂溶性维生素的异常变化与越来越多的疾病及其他生理状态有关[2]。有研究表明VA可促进免疫系统发育[3],增强免疫能力[4],其含量低甚至与成人早期肥胖有关[5];维生素D在某些精神性疾病和糖尿病的预防方面有一定作用[6-7];适宜浓度的VE对癌症预防和糖尿病肾病、非酒精性脂肪肝的治疗有所帮助[8-9];维生素K则与儿童的矮小症和成人的冠心病有一定关联[10-11]。因此,建立一种快速、准确的临床检测多种脂溶性维生素的方法愈发重要,这将大大加快人们研究以及运用各种脂溶性维生素的进程。

近年来,国内外液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术正在快速发展。放射免疫法和酶联免疫法等传统检测方法[12-13]存在放射污染的潜在风险及易与其他非目标化合物发生交叉反应而导致特异性差等缺点。LC-MS/MS具有高特异度、高灵敏度、高准确性等优势,使之在检测领域的各个方面被快速推广[14],特别是在维生素检测方面[15],LC-MS/MS可以同时检测25-羟基维生素D2(25-OH-D2)和25-羟基维生素D3(25-OH-D3)的精确浓度,使之成为国际上公认的维生素D检测的金标准[16]。当然,该方法也面临所需样品量大、前处理复杂耗时且仪器操作较为复杂等问题。为了进一步拓展LC-MS/MS在检测维生素方面的应用,大量学者开展了相关研究,例如陈敏纯等[17]开发了仅需200 μL血清样品即可检测4种脂溶性维生素的方法。本研究则将针对VA、维生素D(25-OH-D2、25-OH-D3)、VE和维生素K1(VK1)5种脂溶性维生素建立LC-MS/MS的检测方法,实现利用更少的样品(100 μL血清),进行简单的前处理过程,使用同位素标记法在短时间内同时对5种脂溶性维生素实现精准定量,并对临床血清样品进行验证,为临床医生的准确判断提供真实、可靠的体内脂溶性维生素水平。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究所选仪器:天津国科医疗科技发展有限公司生产的HTQ 2020高效液相色谱串联质谱检测系统,德国Eppendorf公司生产的高速冷冻离心机,杭州奥盛仪器有限公司生产的氮吹仪;所选试剂:购于美国Sigma-Aldrich公司的VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE,购于上海甄准生物科技有限公司的VA-d4、25-OH-D2-d6、25-OH-D3-d6、VE-d6,购于上海谱芬生物科技有限公司的VK1、VK1-d7,甲酸、甲醇、正己烷、乙腈等均为色谱级试剂;所选样品为2021年10月至2022年6月在沈阳市妇幼保健院健康查体的19例随机健康人血清。

1.2样品前处理 取100 μL标准溶液或样品,为消除人体血清中的不同内源性物质对维生素检测的基质效应,加入10 μL同位素内标工作液,加入200 μL甲醇/乙腈混合溶液涡旋混匀2 min,加入600 μL正己烷,涡旋混匀2 min,4 000 r/min离心5 min,取500 μL上清液,室温氮气吹干,加入乙腈水溶液复溶后上机测试。

1.3液相色谱条件 采用Phenomenex Kinetex C18(50.0 mm×3.0 mm,2.6 μm)色谱柱,柱温设置为40 ℃,流动相A相为0.1%甲酸水溶液,流动相B相为0.1%甲酸甲醇溶液,洗脱程序见表 1,流速为0.6 mL/min,进样体积为20 μL。

表1 梯度洗脱时间程序

1.4质谱条件 采用多反应监测(MRM)、大气压化学电离正离子模式(APCI+),离子源温度300 ℃,气帘气压10 psi,喷雾气压50 psi,加热气压10 psi,碰撞气压9 psi;5种脂溶性维生素的MRM离子参数见表2。

表2 5种脂溶性维生素及其内标的MRM离子参数

1.5定量下限 根据脂溶性维生素的临床检测需求及仪器设备的灵敏度,设置本方法的定量下限:VA为50 ng/mL、25-OH-D2为2 ng/mL、25-OH-D3为2 ng/mL、VE为1 000 ng/mL、VK1为0.5 ng/mL,连续检测12次,计算检测值和理论值的偏差以及测试结果的相对标准偏差(RSD)。

1.6精密度、加标回收率和携带污染测定 (1)按1.2样品前处理方法在含5%BSA标本中添加不同浓度的标准溶液作为质控样品(低浓度质控QCL、中浓度质控QCM、高浓度质控QCH),每个浓度质控样品重复制备3份,按上述分析条件对质控样品进行每天3次检测,连续检测3 d,以衡量其日内精密度和日间精密度。(2)在收集的健康人血清样品中添加不同浓度的标准溶液(QCL、QCM、QCH)获得不同浓度的加标样品,按1.2样品前处理方法对健康人血清样品和加标样品进行处理,每个浓度样品重复制备6份,按上述的检测方法对各加标回收样品进行分析,利用各标准品的校准曲线计算不同样品浓度,各浓度质控样品与实际血清样品的检测值差值与实际添加的标准品浓度的比值作为加标回收率。(3)对该方法的携带污染进行评估,先重复进样低浓度标本,然后交替进样高浓度标本和低浓度标本。通过比较第1次进样的低浓度标本检测结果与随后进样的低浓度标本检验结果的差异,得到携带污染率。

2 结 果

2.1定量下限标本测试结果 VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE、VK1测试值和理论值的偏差均在15%以内,测试的平行标本RSD在15%以内。见表3。

表3 定量下限标本测试结果(n=12)

2.2MRM色谱图与线性测试结果 经上述1.2样品前处理后,在上述色谱条件及质谱条件下获得5种脂溶性维生素及其内标的MRM色谱图,见图1。

图1 5种脂溶性维生素标准溶液及其相对应的内标MRM色谱图

根据VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE、VK1的临床检测需求确定检测范围,并在检测范围需求内设置浓度梯度,检测梯度浓度的标准品,将目标分析物和内标峰面积的比值与梯度浓度进行拟合,得到工作曲线,拟合曲线及曲线方程如图 2所示。由图可知标准曲线呈良好的线性关系,且r值均在0.998以上,因此该检测方法的线性范围分别是VA为50～2 000 ng/mL、25-OH-D2为2～150 ng/mL、25-OH-D3为2～250 ng/mL、VE为1 000～16 000 ng/mL、VK1为0.5～20 ng/mL。

2.3精密度测定结果 日内精密度和日间精密度结果如表4所示,日内精密度在1.87%～8.50%,日间精密度在2.85%～9.81%。

表4 脂溶性维生素低、中、高浓度样品日内精密度和日间精密度考察结果(n=3)

2.4加标回收率测定结果 加标回收率测定结果如表5所示,结果显示在91.47%～107.30%。

表5 脂溶性维生素低、中、高浓度样品加标回收率考察结果(n=6)

2.5携带污染 各脂溶性维生素携带污染率如下:VA为1.32%,25-OH-D2为-0.05%,25-OH-D3为-6.03%,VE为-3.93%,VK1为2.14%。

2.6血清样品检测 使用本方法对19例健康者血清样品进行处理检测,检测结果如下:VA为250.00～730.00 ng/mL,25-OH-D2为0.46～5.82 ng/mL,25-OH-D3为3.97～42.47 ng/mL,VE为2 200.00～13 100.00 ng/mL,VK1为0.13～1.51 ng/mL。空白样品的MRM色谱图如图3所示,人血清样品的MRM色谱图如图4所示。

图3 空白样品中5种脂溶性维生素及其相对应的内标MRM色谱图

3 讨 论

不同脂溶性维生素在不同人群体内的含量差别十分明显,其作用也各不相同,而且往往是多种维生素共同起作用而产生影响。有研究证明孕妇这一特殊群体更易出现25-OH-D2、25-OH-D3缺乏的现象[18],而缺乏VA和VE的新生儿更易发生低体质量和免疫力低下等问题[19],另外骨质疏松症的患者更可能存在维生素D和维生素K缺乏的现象[20]。然而,传统的检测方式难以同时实现对多种脂溶性维生素的准确定量检测。LC-MS/MS可以在较宽的检测范围内快速、准确地获得未知样品中待测物质的浓度,具有更高的特异度和准确度,可以为临床检测提供更为可靠的参考结论,从而更快速地为患者制订治疗方案。但该技术需要的样本量相对较多,操作具有一定的复杂性,使之难以在普通医院推广[21]。因此本研究进一步简化其操作流程,减少样品用量,规范整个检测过程,医护人员仅需简单培训即可掌握该操作,在几分钟内完成整个检测过程。

另外,本研究针对血清中VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE和VK1建立的LC-MS/MS方法检测结果显示,各种脂溶性维生素在标准曲线浓度范围内线性程度良好,日内精密度和日间精密度较为理想,利用新鲜血清进行加标检测证明加标回收率良好,在检测高浓度及其以下浓度标本时不存在明显的携带污染,可满足临床检测要求。而且,针对真实健康者血清样品的检测结果显示,各种脂溶性维生素水平符合当地人群的特点[22],证实本研究所建立的方法切实适合临床检测。

综上所述,本研究成功建立了一种针对人血清中5种脂溶性维生素快速定量的LC-MS/MS方法,不仅操作简单,而且定量准确,适合临床血清样品的检测,可以为临床医生的医学诊断提供真实、可靠的体内脂溶性维生素水平,帮助不同人群进行健康水平判断和相关疾病治疗。