禽白血病抗病育种研究进展

郑文静，田亚东，李转见，李东华

（河南农业大学动物科技学院，河南郑州 450046）

禽白血病(Avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian leukemia virus，ALV)引起的禽类多种细胞肿瘤性免疫抑制性传染病[1]。该病在世界范围内均有发生和流行[2,3]，是影响养禽业发展的重要传染病之一，属于我国二类动物传染病，被列入《国家动物疫病监测与流行病学调查计划（2021—2025）》 防治计划[4]。由于尚无有效的治疗和防治方法，目前主要是通过净化种群来进行预防[5]。在我国的地方品种中均分离出ALV 的亚群，现有的预防手段不能控制AL 的发生和流行。国外已经从研究宿主的遗传抗性方面寻求防控策略。因此，我们可以试图借鉴这种策略来提高AL 的净化效率，降低AL 的传播和流行，培育出更多抵抗AL 的品种。

1 病原学特征

禽白血病病毒属于反转录病毒科，禽C 型反转录病毒属[6]。ALV 属于单股正链RNA 病毒，病毒的基因组顺序从左往右依次为5'-U3-R-U5-gagpol-env-U3-R-U5-3'（其中ALV 的前病毒基因组结构简图见图1[7]），病毒基因组中gag、pol 和env3 个结构基因的作用分别是编码衣壳蛋白、包膜蛋白、囊膜糖蛋白，由于env 基因可以编码出不同的囊膜糖蛋白[8]，根据囊膜糖蛋白的差异性、宿主的范围、基因组结构等，将该病毒分为A-J、K 等11 种亚型[9]。其中A、B、C、D、E 和J 亚群主要存在于自然感染的鸡群中[10]，A、B、J 亚群为外源性病毒，E、F、G、H、I 亚群为内源性病毒，E 亚群是存在于鸡体内的内源性病毒。杜岩等[11]于1999 年在国内肉鸡中首次检出J 亚型，此后，在蛋鸡和地方品系中也发现J 亚群的流行，对我国养禽业造成严重影响。此外，在我国地方品种鸡群中分离和鉴定出了一个新的致病力较弱的ALV-K 亚型[12,13]。

图1 ALV 前病毒基因组结构简图

2 流行病学特点

禽白血病病毒可感染各种年龄的鸡，但其主要感染鸡群是雏鸡。在雏鸡中，其感染高峰一般发生在出壳后7d，高峰期在4～5 周，而在成鸡中，感染高峰一般发生在12～24 周。ALV 主要通过血液和消化道传播，通常呈垂直传播。经口途径的传播可能是通过粪便污染的饲料、饮水或接触被污染的鸡群而实现的。ALV 在不同动物中具有不同的生物学特性，对鸡的危害较大。根据感染的部位不同，可将ALV 分为血源性和组织源性两类。血源性ALV 主要见于雏鸡和成年鸡，可通过血液、脐带或粪便传播，其感染鸡群数量多且常呈地方性流行。除血源性ALV 外，在雏鸡中也发现组织源性ALV 病毒，其对雏鸡的危害远大于血源性ALV，以产蛋母鸡感染最为常见。对于ALV 已有大量文献进行了详细论述，但目前针对该病的研究大多集中于病原特性、临床症状等方面，而对于其流行特点研究较少。

3 禽白血病病毒检测方法

禽白血病表现出的肿瘤症状与马立克氏病等临床症状存在很大的相似性，很难用肉眼来准确鉴定，常常借助实验室的方法来进行确诊，ALV检测的方法主要有血清学检测、p27 抗原ELISA检测、细胞培养分离鉴定病毒和核酸检测。

3.1 血清学检验

血清学检验通常用双抗夹心ELISA 方法，该方法常常用于筛选外源病毒感染，具有简单、操作方便、可用于大批量鸡群检测的特点，常常用于判定SPF 鸡群有无感染，该方法的缺点是对内源性病毒无法进行筛选。

3.2 病毒分离鉴定

病毒分离鉴定是检测外源性ALV 最有效的手段。该方法特异性高，可分离和保存流行病株并鉴定其亚群，对致病性进行进一步试验。但是该方法存在技术要求高、需要特定实验室、成本高、周期长等缺点。

3.3 核酸检测方法

核酸检测可用PCR/ 荧光定量PCR/ 核酸斑点分子杂交的方法。该种方法可直接检测各种样品中的病毒感染，具有方法简单易学、出结果快、成本低的优点。但也存在较高比例的假阳性和较高比例的假阴性，可重复性较差。

4 禽白血病病毒净化

禽白血病病毒是一种垂直传播性病毒，病毒从曾祖代传播到父母代到商品代逐代放大。虽然各国研究人员都在致力于开发禽白血病的疫苗和具有针对性的药物，但都没有好的进展和效果[14]。目前，预防和控制AL 的主要措施仍是对原种鸡场鸡群进行净化，将感染的鸡群筛除，建立无ALV感染的核心种鸡群是首选的最有效的防治方法[15-17]。目前，在国内，通常采用崔治中[18]教授提出的禽白血病核心鸡群的四大净化原则。在生产中，对核心区母鸡通常在4 个关键节点开展筛查[4]：一是检测1d 雏鸡胎粪中的p27 抗原，并对筛查出的阳性鸡进行淘汰。二是采集鸡（6～10 周）的血浆对病毒进行分离鉴定从而淘汰阳性鸡。三是采集开产初期母鸡（23～25 周）初产蛋的蛋清p27 蛋白抗原进行检测淘汰阳性鸡。四是检测留种前种蛋蛋清p27 蛋白抗原淘汰阳性鸡。此外，对于核心种公鸡可采取鸡的精液开展病毒分离鉴定[19]。种鸡场在生产中可以根据自身的实际情况挑选上述任意一个时期开展净化工作[20]。种禽场在开展净化的同时，需要加强饲养管理，做好生物安全防控，避免发生因净化不到位而引起ALV抗原和抗体突然升高的现象。

5 禽白血病受体遗传的多样性

随着ALV 病毒的不断变异，出现了越来越多的ALV 亚型，严重影响养禽业的发展。各种不同的亚型病毒因为env 蛋白出现差异从而出现不同的宿主蛋白。tva 是A 和K 亚型的蛋白受体，tvb 是B、D、E 亚型的蛋白受体，tvc 是C亚型的蛋白受体，chNHE1 是J 亚型的蛋白受体。不同亚群的ALV 由不同的细胞受体进入宿主细胞，从而发生感染[21]。由于受体基因的遗传变异从而导致受体蛋白的表达缺失或者表达为不适合病毒受体的缺陷型蛋白，进而使宿主细胞产生对某种ALV 亚型的抗性或者导致对ALV 不敏感[22]。tva 决定A 亚群病毒的易感性，tva 决定B、D、E亚群病毒的易感性，tvc 决定C 亚型病毒的易感性，chNHE1(tvj)决定着J 亚群的易感性。

5.1 tva 基因的遗传多样性

tva 是编码ALV-A 亚群和ALV-K 亚群的病毒感染的tva 受体蛋白基因，决定对ALV-A 的易感性和抗感染性[23]，包含6 个抗性基因（tvar1、tvar2、tvar3、tvar4、tvar5和tvar6）和一个易感基因（tvas），抗性基因是tva 的复等位基因[24]。由于tva受体基因发生遗传突变从而导致受体蛋白缺失或者表达一个不适合ALA-A 受体的缺陷型受体蛋白。tvar1是tva 基因的第619 位碱基（C＞G），引起对应编码的半胱基酸（Cys）突变成色氨酸（Trp），从而降低了A 亚型囊膜糖蛋白与受体的亲和力，产生对A 亚型的遗传抗性。tvar2是由于外显子基因C305-306位点插入4（CTCG）个碱基，导致tva 蛋白缺失，产生对A 亚型的抗性[25]。tvar3是tva 基因（C507-516）序列缺失10 个碱基（ACCCCGCCCC）；tvar4是tva 基因（C507-511）的序列缺失5 个碱基（ACCCC），tvar3和tvar4碱基的缺失干扰了mRNA 的剪接，导致内含子或终止密码子TGA 过早出现，降低了tva 受体蛋白与病毒囊膜蛋白的亲和力，从而使ALV-A 的易感性降低[26]。抗性基因的出现，为ALV-A 的防治及培育新的品种提供了指导和方向。

5.2 tvb 基因的遗传多样性

tvb 基因是编码ALV-B、ALV-D 和ALV-E亚群病毒感染的tvb 蛋白受体，是引起肿瘤坏死因子受体家族[27]。tvb 的遗传抗性基因位点有5 个（tvbs1、tvbs3、tvbr1、tvbr2和tvbT）。因为tvbs1的碱基没有发生突变，所以对ALV-B、ALV-D、ALV-E 亚群易感；tvbs3是由于单碱基发生突变（T ＞A），产生抗E 亚群的特性，tvbr1碱基发生突变，导致氨基酸终止密码子提前出现，受体蛋白的机构发生改变，最终产生ALV-B、D、E 抗性[28]。tvbr2是由于单碱基突变从而使半胱氨酸（Cys）突变为丝氨酸（Cas），tvb 的蛋白区域结构发生改变，产生抗E 亚群，降低对B、D 亚群的易感性[29]；tvbT存在于火鸡中，对ALV-B、ALV-D 亚群具有抗性，但是对ALV-E 亚群具有易感性[30]。由于tvb 蛋白受体家族庞大，引起的AL 亚型复杂，给核心群筛选净化带来诸多不变。

5.3 tvc 基因的遗传多样性

tvc 基因是编码ALV-C 亚型的tvc 蛋白受体，由于该蛋白基因存在于鸡28 号染色体上，所以两者存在连锁现象。tvc 有两种基因（tvcs、tvcr），tvcs是引起ALV-C 亚型感染的基因，由于C 亚型在临床上感染率低，生产中很难进行测定，只有通过定位克隆进行鉴定[31]。tvcr是单碱基（C＞A）突变，从而提前终止密码，产生抗性等位基因，最终对生ALV-C 亚型产生抗性。虽然C 亚型在群体中不常见，但我们也不能忽略对该亚型种群的筛查。

5.4 tvj 基因的遗传多样性

chNHE1 是编码ALV-J 感染的受体蛋白，chNHE1 在低PH 值条件下，可以介导ALV-J 与靶细胞膜融合[32]。tvj 存在两种等位基因，分别是tvjs和tvjr。tvjs是tvj 的易感基因体，可诱发ALV-J 亚型的易感，tvjr是外显子W38 缺失或突变而产生的复等位基因，对ALV-J 具有抗性。J亚型在世界白羽肉鸡中广泛流行，在2005 年已实现净化。但是，国内ALV-J 在白羽肉鸡流行后，迅速传播到蛋鸡和其他地方品种中，给我国养禽业带来严重危害。

6 禽白血病抗病育种的途径

6.1 利用受体基因的遗传抗性

由ALV 亚型的遗传多样性可知，在生产中可以设法选出或者利用生物标记技术标出AlV-A亚型的抗性等位基因tvar1和tvar2；AlV-B 亚型的抗性等位基因tvbs1、tvbr1和tvbr2；AlV-C 亚型的抗性等位基因tvcr；AlV-J 亚型的抗性等位基因tvjr。将标记出来的抗性等位基因个体进行纯化，利用杂交的方式培育出抗性基因多的品种和品系，从而达到ALV 亚型综合防治，提高家禽生产性能的目的。

6.2 利用半性遗传（K）基因育种

由于慢羽鸡比快羽鸡对AL 敏感且更难净化。起初因为K 基因与ALV 的一个e21基因存在紧密连锁关系[33]，人们开始研究e21是否能引起慢羽鸡的生活力下降。Bacon 等[34]经检测发现，慢羽鸡体内均携带ev21基因，而快羽鸡体内没有ev21基因。Smith 和Fadly[35]的研究表明，ev21可以引起鸡对ALV 产生免疫耐受性，提高外源AL 的易感性。白春艳等[36]研究发现，慢羽鸡比快羽鸡易感AL，谭艳等[37]研究表明，快慢羽鸡抗ALV-J 的天然免疫反应差异显著性明显，并且慢羽鸡抗ALV-J 的天然免疫反应比快羽鸡迟钝且强度较弱。上述研究为我们培育抗病性能好的快慢羽鸡提供了数据支撑和理论依据，有利于培育抗AL性能的品系。

7 小结

禽白血病作为垂直传播的传染病之一，由于亚型较多、传播速度快，缺乏疫苗和针对性的药物进行防治，给全球养殖业带来了巨大的经济损失。现实生产中可通过分子生物学手段标记出ALV 抗性基因，培育具有抗性基因的品种来防治ALV 的感染。伴性遗传中慢羽鸡与快羽鸡在抗ALV-J 中的天然免疫具有明显差异，但是慢羽鸡携带的e21可能还在天然免疫中还扮演着其他角色，所以，对于通过羽速来培养抗ALV 感染的品种（品系）鸡群，还有待进一步研究。