印记基因在孤雌生殖方面的研究进展

彭晟坤，张子敬，张格阳,3，张志浩,3，闵 佳,3，李欣淼,，王香南，施巧婷，祁兴山，黄永震，李惠侠，王二耀*

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所/河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南郑州 450002；2.南京农业大学动物科技学院，江苏南京 210095；3.河南农业大学动物科技学院，河南郑州 450002；4.西北农林科技大学动物科技学院，陕西西安 712199；5.泌阳县夏南牛科技开发有限公司，河南驻马店 463700）

孤雌生殖中涉及到印记基因的表达调控和遗传机制，目前，印记基因的研究主要集中在DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA（lncRNA）等表观遗传学特征上，而在孤雌生殖领域的研究相对较少。由于缺乏父方参与，在印记基因的调控中，需要对父母方特异性地基因组进行表观遗传修饰，而孤雌生殖过程中无法通过雄性个体提供的基因组印记来调节基因表达，就会导致不同时期胚胎发育异常或者早期死亡[1]。在胚胎发育过程中，通过表观遗传调控，可以使某些印记基因在雌性个体中失活或沉默，从而实现孤雌生殖。在抗病育种方面，孤雌生殖作为一种具有极大潜力的应用方案，目前在畜牧业中应用还较少。本文介绍了孤雌激活的方式，孤雌胚胎获取方式和印记基因在孤雌生殖中的应用，以期为未来孤雌生殖的相关应用提供思路，从而提高畜牧业的生产力和可持续发展。

1 孤雌生殖技术

1.1 孤雌生殖技术意义

孤雌生殖仅涉及到雌性个体的基因，后代继承母体的所有基因，利用孤雌生殖的遗传学机制，可以使携带特定基因突变或缺失的卵子发育成具有相应遗传特征的后代，同时，孤雌生殖技术可通过孤雌激活等方法实现对母体基因的保留，可用于特定动物品种和濒危动物品种的繁殖和保护，有助于保持物种的基因多样性。孤雌生殖可以与多种生物技术结合，可以为疾病治疗、干细胞多能性、胚胎学研究、基因突变和遗传病筛查等领域提供新的可能性和解决方案，具有极高的应用价值。

1.2 孤雌生殖技术优势

通过孤雌生殖技术繁殖的后代具有较高的基因稳定性，利于进行基因改良和基因编辑，同时通过选择具有优良基因的个体进行孤雌生殖，可以保证部分优良性状的稳定维持。孤雌生殖可以使雌性个体独立地繁殖后代，无需等待或依赖雄性个体的参与，利于短时间内快速扩繁，提高了繁殖效率。孤雌生殖只涉及母方的基因组，可以降低疾病传播的风险，减少病原体传播的机会，尤其是在疾病高发地区或疫情暴发时期具有重要意义。

1.3 孤雌生殖技术劣势

孤雌生殖技术的也可能存在一些限制和挑战：孤雌生殖后代仅继承母体的所有或者部分基因，这可能会降低后代之间的基因多样性。此外，哺乳动物孤雌生殖技术的操作相对复杂，成功率相对较低，需要较高的实验技术和专业的实验室条件，可能导致孤雌生殖成本较高。

2 孤雌胚胎激活方法

孤雌激活是指人工诱导未受精的卵母细胞继续生长发育的过程，通过对卵母细胞进行特定的实验处理可以产生单倍体或双倍体孤雌胚胎。同时，激活效果还受使用化学物质种类和浓度、处理时间、动物种类和胚龄等影响[2,3]。

2.1 物理激活法

物理激活法包括机械刺激、温度刺激以及电刺激处理等，其中最常用的是电刺激法处理卵母细胞。电刺激法通过将电脉冲或电流施加到卵母细胞周围的培养液中来以改变细胞膜的电位，进而引发细胞内的离子流动和信号传导，最终激活卵母细胞的发育能力。

2.2 化学激活法

化学激活法是利用渗透压刺激、离子处理、酶刺激、麻醉刺激以及蛋白质合成抑制剂处理等方法来刺激卵母细胞，触发细胞内的信号传导路径，从而激活其发育能力[4]。常用化学激活法可以通过促进细胞内钙离子浓度升高、抑制成熟促进因子（MPF）、调节细胞周期、改变细胞内环境等方法来激活卵母细胞发育能力，通常促进细胞内钙离子浓度升高的化学物质有钙离子载体、离子霉素、氯化锶（SrCl2）、聚乙二醇（PEG）和钙离子载体A23187 等[5,6]。

2.3 物理与化学联合激活

物理与化学联合激活法是将物理激活法和化学激活法结合起来使用，通常可以增强激活效果，物理激活可以改变细胞膜的通透性，加速化学物质进入细胞，而化学激活可以调节细胞内信号通路，促进或抑制特定基因的表达。如在体外受精技术中，可以先使用电刺激激活卵母细胞，然后再添加化学物质来进一步促进发育。如Kragh 等[7]使用电刺激脉冲激活体外成熟的无透明带猪卵母细胞，在放线菌酮（CHX）和细胞松弛素B（CB）中培养后，激活效果较好并得到较高的囊胚率。

3 单倍体和双倍体孤雌胚胎获取

激活卵母细胞使其进入MII 期后，形成第二极体过程中，卵子通常会排出第二极体，形成单倍体孤雌胚胎。但研究人员可以使用物理和化学方法等去除或禁止第二极体的排出，或者让第二极体再次融合，就有可能形成双倍体孤雌胚胎。

3.1 单倍体孤雌胚胎获取

单倍体孤雌胚胎只有一套染色体，可以用于遗传学、基因功能与性状作用机制中的研究。为获单倍体孤雌胚胎，Leeb 等[8,9]用氯化锶（SrCl2）激活未受精卵细胞，从活化卵母细胞中培养出胚胎干细胞（ESC），对ESC 进行扩增后可用流式细胞仪分离出二倍体细胞或富集单倍体细胞，最终得到可稳定传代超过35 次的孤雌单倍体胚胎干细胞系（PG-haESCs）。Zhong 等[10]利用离子霉素和环己亚胺（CHX）处理卵母细胞，使其排出第二极体，产生单倍体细胞，可以将获得的单倍体细胞进一步培养和衍生出ESC 株系。然而，在该ESC 株系的第4～8 代中，使用Hoechst 33342染色的荧光激活细胞分选（FACS）无法富集到单倍体细胞。尽管如此，他们通过从受精卵细胞中去除雄性前核的方式获得了孤雌单倍体细胞，通过定期进行荧光激活细胞分选（FACS）来有效地维持单倍体细胞水平，并成功获得两种衍生出的PG-haESCs，这些PG-haESCs 可以在标准的人类ESC 培养条件下稳定传代达到30 次，并且这些细胞在衍生和传代过程中都保持了基因组的完整性。。张曼玲等[11]采用电激活、9%乙醇、电激活结合Thimerosal、DTT 和电激活结合MG-132 处理获得单倍体囊胚的总效率分别为7.3%、4.1%、5.0%和1.7%，发现电脉冲处理的激活方法获得猪单倍体孤雌胚胎的效果较好。

单倍体孤雌胚胎在研究基因功能、基因印记和复杂发育生物学方面具有显著优势，但仍存在自发二倍体化、注入单倍体细胞后胚胎发育效率低、Y 染色体缺失、无法建立大型动物单倍体孤雌胚胎干细胞系等缺陷[12]。

3.2 双倍体孤雌胚胎获取

二倍体孤雌胚胎获取过程与单倍体孤雌胚胎获取过程类似。研究表明，通过控制激活过程，不同化学组合会对激活卵母细胞后的倍性产生影响，Qiu 等[13]使用乙醇、SrCl2、6-DMAP 和CB来激活MII 卵母细胞，发现二倍孤雌胚胎发育率明显高于单倍体型，而SrCl2与CB 联合处理4 小时可产生最高的二倍孤雌胚胎发育率。Loi 等[14]发现，CB 和6-DMAP 培养可产生高比例的二倍体孤雌胚胎。此外，有研究发现细胞融合或核内复制可能导致单倍体孤雌胚胎出现自发的二倍体化[8]。

4 印记基因在孤雌生殖中的作用机制

印记基因是一类参与胚胎发育、生长和成熟过程中的表观遗传调控的基因，它们在孤雌生殖中起着重要的调控作用。印记基因通过DNA 甲基化和组蛋白修饰等表观遗传调控机制来影响参与发育和分化基因的表达，控制胚胎发育并通过各种促进或抑制生长的途径来发挥作用，可以影响个体生殖细胞的发育和功能，从而对孤雌生殖的成功率产生影响[15-17]。有研究表明印记基因可以影响孤雌生殖后代的性状，父方印记基因主要加速胚胎的发育，倾向于保证胎儿生长，而母方印记基因主要限制胚胎发育速度，倾向于保证胎儿的顺利分娩[18]。另有研究表明，印记基因的异常表达或突变可能与孤雌生殖相关，同时可能导致印记紊乱为特征的一些相关疾病，如Beckwith-Wiedemann 综合征和Angelman 综合征等[19]。此外，印记基因的异常表达还可能对个体的生存产生影响，导致胚胎在发育过程中死亡[20]。

5 印记基因在孤雌生殖中的研究

Feil 等[21]通过比较羊孤雌生殖胚胎和正常对照胚胎的印记基因保存情况，发现绵羊的孤雌生殖发育与生长迟缓有关，并且不会超过胎儿早期阶段，他们认为这些发育异常很可能是由印记基因引起的，而与小鼠相比，印记基因在反刍动物中相对保守，这和Loi 等[14]的研究结果相一致，绵羊孤雌胚胎同样在植入后不久死亡，他们认为胎儿致死现象可能发生在妊娠第25～26 天，同时也是胎盘形成的阶段。Thurston 等[22]对绵羊孤雌胚胎9 个印记基因的表达进行检测，发现在囊胚期即胚胎植入之前印记基因的表达模式类似于双亲表达，而在胚胎植入之后，这些印记基因开始表现出单等位基因表达的特征。Kono 等[23]首先证实一部分印记基因是哺乳动物孤雌生殖的障碍，但只要适当地调节印记基因的表达，哺乳动物可以通过孤雌激活产生能够发育到成年并繁殖后代的个体。他们使用一种具有13kb 缺失的H19基因突变小鼠作为非生长期卵母细胞的供体，通过去除非生长期卵母细胞中的纺锤体和第一极体，将其移植到去精核的生长期卵母细胞中，并使用体外激活卵母细胞的方式获得了能够发育成年的双倍体孤雌小鼠，结果小鼠能够通过体外受精和移植产生正常的后代，但存在繁育率过低，小鼠生长发育存在缺陷的问题。Wang 等[24]研究了猪孤雌胚胎和正常受精胚胎（Con）的18 个印记基因的表达情况，发现在孤雌胚胎和胎盘中，母源基因过度表达，而父源基因表达显著减少，同时与X 染色体失活相关的甲差异化基化区域（XIST DMRs）呈现低甲基化，表明缺乏父系基因表达和X 染色体失活（XCI）失败可能是猪孤雌胚胎发育失败和生长受阻的潜在原因。Li 等[25]发现单倍体胚胎干细胞中的基因组印记相对较少，印记基因对于胚胎发育潜在的影响也更容易消除。他们使用实验室培养的小鼠精子或卵子培育出单倍体孤雄胚胎干细胞（AG-haESCs）或单倍体孤雌胚胎干细胞（PG-haESCs），通过基因编辑技术删除了这些细胞中印记基因的部分ICR 区域，培养出与卵巢体细胞类似的胚胎卵巢体细胞样细胞（FOSLCs），构建了一种具有两个父亲或两个母亲的新型胚胎，实验结果显示，有两个母亲的小鼠能够存活到成年，并具有生育能力。这一结果表明，印记基因可能在调控孤雌生殖中有重要作用。Wei 等[26]证明通过对小鼠卵母细胞的印记控制区（ICR）进行有针对性的DNA 甲基化重写，可以在哺乳动物中实现孤雌生殖。他们使用CRISPR-dCas9 通过Dnmt3a 甲基化酶来增加两个父系基因组印记控制区域H19 和Gtl2 的甲基化，并使用CRISPR-dCpf1 通过Tet1 去甲基化酶实现母系基因组印记控制区域Igf2r、Snrpn、Kcnq1ot1、Nespas 和Peg10 的去甲基化，将这些基因编辑后的卵母细胞植入到雌性小鼠的子宫中，最终获得了可存活足月的后代，成功实现了小鼠单个卵细胞的孤雌生殖。

6 展望

目前，印记基因在孤雌生殖中的研究已经有了显著成果，但将其应用于畜禽产业的生产实际仍存在一定的距离，印记基因在孤雌生殖中的研究还有很大的应用潜力，未来的研究应进一步探索更多的印记基因与孤雌生殖相关的基因，深入研究印记基因与孤雌生殖的分子机制，并开发相关孤雌生殖模型和在猪、牛、羊等畜禽中应用的方法。在育种方面，需通过表型选择和分子标记辅助选择，筛选出具有优良性状的雌性个体，结合孤雌生殖技术有望加速育种进程并提高品种质量。随着基因测序技术的不断发展，高通量测序等手段结合孤雌生殖也有望加快抗病性基因资源的利用。在抗病品种选育方面，结合基因编辑和分子标记等技术，孤雌生殖在特定领域的应用也有巨大潜力。相信随着孤雌生殖技术不断取得突破，它将在畜牧业和生物工程领域发挥更大作用，并为畜禽抗病育种提供新的途径。