甘露糖结合凝集素（MBL）基因遗传多态性及与奶牛乳腺炎抗病相关性研究

肖龙菲，王相国

（北京农学院动物科学技术学院，北京 102206）

乳腺炎是乳腺的一种炎症性疾病，是奶牛的主要疾病之一，它通常是由乳房内细菌感染和化学、热或机械损伤引起，金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性微生物）和大肠杆菌（革兰氏阴性微生物）是主要的乳腺炎病原体，其次是酵母菌和真菌。乳腺炎的发生不仅导致牛奶质量和数量的下降，还可引起泌乳持续性降低和奶牛过早淘汰，严重制约畜牧业的发展，造成巨大经济损失。一直以来主要依靠免疫接种或药物治疗等方法防治乳腺炎，但这没有从根本上消灭和控制疾病的发生和流行，且易引发耐药菌株和抗生素残留等公共卫生问题。先天免疫系统被认为是保护宿主免受生物体入侵的第一道防线[1]。其中牛补体系统在乳腺的防御机制中发挥着重要作用，有助于溶解入侵的病原体并调节炎症。乳头浸泡、干奶疗法和疫苗接种可用于控制牛乳腺炎，但仍存在一定困难。研究证实，家畜对许多感染性疾病的抗性是由遗传调控的[2]。从长远来看，采用遗传学方法从遗传本质上提高牛对病原的抗性，开展抗病育种具有治本的功效。因此应用现代分子生物学技术分析抗性和易感群体中候选基因的标记等位基因频率差异，结合遗传育种技术，从根本上提高家畜的抗病性与健康水平已成为当今家畜抗病育种研究的热点。

1 甘露糖结合凝集素与凝集素途径

补体系统是体液免疫的效应机制，包括30多种可溶性和膜结合蛋白，是动物先天免疫的重要组成部分[3]。补体系统中的许多蛋白质是由丝氨酸蛋白酶作为循环中的酶原，随着时间的推移，一旦补体系统被激活，就会发生一系列涉及蛋白水解和组装的反应，导致第三个补体成分C3裂解，从而诱导补体的活化。目前发现补体的激活主要有3 种途径：①经典途径；②替代途径；③凝集素途径。凝集素途径由甘露糖结合凝集素（Mannose-binding lectin,MBL）激活，其一般是在与抗原抗体发生特异反应之前，凝集素与细菌细胞表面的甘露糖相互作用，激活机体的免疫反应而发挥作用[4]。MBL 是一种钙依赖性胶原C 型凝集素，参与对各种微生物病原体的先天免疫反应。血浆MBL 与其他胶原凝集素相同，由多个三聚体组成，每个三聚体包含4 个不同的结构域：一个富含半胱氨酸的N 端结构域、一个胶原蛋白样结构域、一个颈部区域和一个C 端碳水化合物识别结构域[5]。它们通过二硫键和胶原蛋白样结构域的三螺旋缔合朝向N 末端结合在一起。MBL 的识别结构域通过与细胞表面上的甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖残基结合，并随后与3 种称为甘露糖结合相关蛋白酶的丝氨酸蛋白酶（MBL associated serine protease，MASP）形成复合物。MASP2 位于16 号染色体上，包含11 个外显子，是裂解C4 和C2 以组装C3 转化酶（C4b2a）的关键蛋白酶。MASP2 与经典补体途径转化酶共同作用，进而激活补体级联[6]，从而诱导吞噬和炎症反应[7]，发挥调理作用和中和作用，实现抗菌功能。而MASP-1 和MASP-3 似乎参与了凝集素和旁路途径的激活。

MASP2 基因在先天免疫中发挥重要作用，并产生对乳腺感染的抵抗力。MASP2 中的多态性与奶牛较低的牛奶SCC 和乳腺炎抵抗力具有显著相关性。此外，MBL 利用巨噬细胞上的C1q 受体调理细菌，而不涉及补体，调节吞噬细胞释放的炎症细胞因子，并抑制病毒感染性。

大多数哺乳动物物种中都有2 种类型的MBL，即MBL-A 和MBL-C，分别由MBL1 和MBL2 基因编码。MBL1 和MBL2 突变已被证明会改变动物对各种感染的易感性[5]。猪和牛中的MBL1 可被视为乳腺炎抗性和补体活性的功能和位置候选基因[8]。有研究表明MBL1 基因可能有助于提高针对细菌感染的抵抗力，并且可以作为产奶性状的分子标记来控制乳腺炎[9]。近年来，一种通过分子标记选择性育种提高宿主对乳腺炎遗传抵抗力的方法已被广泛接受。对疾病的抵抗力通常受宿主遗传特性影响，因此识别所涉及的靶基因，并通过遗传标记辅助来增加所需基因的频率，可有效控制病原体的感染传播。

2 MBL 基因多态性与奶牛乳腺炎的关系

2.1 单核苷酸多态性选择技术

近年来，随着遗传学、分子生物学技术和统计分析方法的不断进步，动物学家们提出了一种新的育种策略，即动物分子育种。传统的育种技术主要依靠对表型性状的遗传参数估计和育种值评估，以选择出优秀的种畜。而在奶牛分子育种方面，研究内容主要包括以下3 个方面：一是数量性状基因座育种，即通过定位数量性状位点（Quantitative trait locus，QTL）中的主效基因进行品种改良，或是与其紧密关联的DNA 标记来进行标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS）；二是转基因育种，该方法是通过基因转移技术将外源性基因导入奶牛基因组中，以改良奶牛的重要生产性状或非常规性育种性状；三是单核苷酸多态性选择技术（Single-nucleotide polymorphism，SNP），这是利用与性状紧密相关的SNP 位点进行选择。通过这些方法，研究人员逐渐从操纵数量性状的表型过渡到操纵数量性状的基因型，从依赖表型选择转变为MAS，最终实现目标的分子育种。

目前，关于调节乳腺先天免疫基因中SNP 的检测，已在乳腺炎的防控中得到广泛关注[9-13]。已有多种免疫和炎症相关基因及其多态性研究已被发现与奶牛乳腺炎的易感性/ 耐药性密切相关[14]。研究显示，在中国荷斯坦奶牛MBL2 外显子1 中发现了4 个新的SNP，分别位于牛MBL-C 的胶原蛋白样结构域的富含半胱氨酸结构域和Gly-X-Y 重复结构域的N 末端，可能通过影响蛋白质功能的编码区的非同义核苷酸多态性引发疾病[15]。该假设得到以下论证的支持：首先，哺乳动物中MBL-C 的基本结构是3 个相同单体的三聚体。N 末端的一个富含半胱氨酸的小结构域在3 个单体之间形成二硫键，从而稳定三聚体。这些半胱氨酰残基对于高阶寡聚体的形成和稳定中发挥关键作用。其次，MBL-C 蛋白缺陷主要是由氨基酸取代引起，即MBL2 外显子1 中精氨酸被谷氨酰胺取代，导致二硫键排列异常，引发配体结合活性和补体激活降低[16]。最后，与N 末端结构域相邻的是一个大的胶原蛋白样结构域，该区域由大量Gly-X-Y 重复序列组成，形成卷曲螺旋，为三级结构提供稳定性，同时与凝集素补体途径的激活和调理免疫有关。胶原蛋白样结构域的N 末端与调控细胞吞噬作用有关，包括与C1q受体相互作用的保守GEKGEP 基序。同时，在C末端内有几个保守的氨基酸残基，这些残基形成的MASP 结合基序[17]和MBL 三聚体的结合[16]，因此胶原结构域中氨基酸的各种SNP 可能会导致MBL2 功能异常。

甘露糖结合凝集素是属于集合素蛋白家族的关键参与者，它与多种微生物结合并调节先天免疫凝集素补体途径[18]，有研究表明MBL 有助于清除体内凋亡细胞[6]。牛MBL1 已被映射到BTA28。在这个区域，它包含影响体细胞评分（Somatic cell score，SCS）的数量性状基因座。此外，其他研究也报道了MBL 中的SNP 与牛奶SCS 的显著关联[19]。

2.2 突变位点基因型鉴定

在研究MBL1 基因位点片段时，可以通过以长片段PCR 产物为模板进行短片段的扩增即巢式PCR 技术进行检测。巢式PCR 也称套式PCR，是指利用两套PCR 引物对进行两轮PCR 扩增反应。巢式PCR 技术，克服了单次扩增“平台期效应”的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了PCR 的敏感性；由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性，从而确保整个反应的准确性及可行性。创造酶切位点技术（CRS-PCR）是根据引物碱基错配技术设计的检测单碱基突变的简单易行的方法，其原理是：根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计PCR 引物，其中一条引物包含错配碱基，使得引物3'端和单碱基突变的一种突变型在PCR 扩增后形成一个酶切位点，其PCR 产物可用类似PCR-RFLP 方法进行分析。若无天然酶切位点，则可利用CRS-PCR 提高SNP 检测的效率，降低试验成本，是一种良好的单碱基突变位点基因型鉴定方法。

2.3 MBL1 与牛奶SCS 的相关性分析

奶牛MBL1 基因SNP 与多种乳成分性状密切相关。研究发现，牛奶中低SCS 的GG 基因型有利于抵抗乳腺炎的发生，而高SCS 的AA 基因型则导致乳腺炎易感。增加MBL1 p.24Val 的频率可反映奶牛乳腺炎的抵抗能力，因此研究MBL1 多态性似乎是改善奶牛乳腺炎抵抗性状的重要的间接标记[20]。

有研究发现，MBL1 基因中的SNP g.2651G＞A 与乳汁SCS 有强相关性，表明其可能在乳腺炎抵抗中发挥作用[21]。g.2651G＞A 位点的AA 基因型个体与SCS 有显著相关性，说明g.2651G＞A 位点当DNA 两条链上的G 都突变为A的时候，血清MBL-A 水平过低可造成机体调理功能缺陷而易患多种感染性疾病，也可能是MBL1 突变体介导体内某些细胞摄取某些胞内微生物如金黄色葡萄球菌，从而使机体易患此类感染，奶牛的乳腺炎抗性显著减弱。因而在乳腺炎抗性牛群选育计划中应有意识地增加g.2651G＞A位点的G 等位基因频率[22]。在分析的中国荷斯坦牛群体中，3 个SNP 与产奶性状（脂肪含量、蛋白质含量和305d 产奶量）之间未观察到显著相关性。然而，有趣的是，三个SNP 的组合基因型与产奶性状之间发现了显著差异，表明一种SNP的基因型效应可能受到其他SNP 的影响并且这种效应是多个SNP 相互作用的反映[21]。Liu 等[23]研究发现，MBL1 基因与中国荷斯坦、鲁西黄、渤海黑的牛奶SCS 呈正相关，可能在宿主对乳腺炎的反应中发挥关键作用，并且g.2651G＞A 和g.-1330G＞A 可用于奶牛乳腺炎抗性育种。除此之外，Liu 等[23]认为与SNP 相比，单倍型组合的分析可能对性状产生更大的影响，标记辅助选择比单个SNP 的研究更有价值。在荷斯坦奶牛中的单倍型组合中，应选择H8H22、H5H1、H16H22、H15H1 和H5H1 作为单倍型组合的标记，以分别获得更高的产奶量、脂肪率、蛋白质率以及乳腺炎抗性和CH50 值。此外，g.2651G＞A SNP 与血清MBL-A 水平呈显著正相关，表明高MBL 血清水平和低MBL 血清水平之间的比率取决于MBL编码变体[24]。因此，血清溶血活性可以被认为是抗病性的遗传标记和可以选择用于近交计划的性状。此外，-1330 G＞A 和g.2651 G＞A 同样与CH50 呈显著正相关，证实MBL1 可被视为补充CH50 活性的功能和位置候选基因。抗菌实验进一步证实，与来自易感奶牛的血清相比，抗病奶牛血清对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抗菌活性显著升高[24]，该发现为H15H1 基因型对主要牛乳腺炎病原体感染的保护作用以及H16H8 基因型对此类感染的诱发作用提供了生物学意义。

有研究表明，荷斯坦牛、三河牛和西门塔尔牛MBL 外显子存在3 种不同的基因型，即AA（(217 bp）型、AG（217、194 和23bp）型和GG（194 和23bp）型[24]。c.2534G ＞A SNP 可能对蛋白质功能产生负面影响，因为编码区的突变可能会在很大程度上改变蛋白质结构，或通过破坏残基间相互作用来破坏活性位点部分的稳定性。基因型与临床型乳腺炎发病率的关联显示，AA 基因型更易患乳腺炎，其次是AG，而GG 基因型则不易患临床型乳腺炎。

细菌感染是引起奶牛乳腺炎的最主要因素，因此对奶牛MBL2 基于SNP 分析可能有助于发现它们与乳腺炎抵抗力的关联。Zhao 等[13]研究发现，g.1164 G＞A-GG 和g.1197 C＞A-CC 基因型奶牛的SCS 显著降低，表明这些基因型可能与群体乳腺炎抵抗力有关。因此，可选择GG、CC 基因型牛进行选育。突变位点（g.1198 G＞A 和g.1207 T＞C）的任何标记基因型与产奶性状或SCS 之间均未观察到显著相关性。4 个SNP（g.1164 G＞A、g.1197 C＞A、g.1198 G＞A 和g.1207 T＞C）的组合基因型与产奶性状（蛋白质率）密切相关。

Wang 等[8]研究表明，中国荷斯坦奶牛MBL2基因在诱导抗原特异性免疫之前激活免疫反应，低表达MBL2 可使奶牛乳腺易感金黄色葡萄球菌。MBL2 基因外显子1 存在多态性，单倍型组合H4H5 可用作乳腺炎抗病性单倍型组合的分子标记。Wang 等[8]认为MBL-A 和MBL-C 在牛体内具有不同的糖结合特异性。动物血清中总补体溶血活性的高低与机体的抗感染免疫能力相关，通过牛奶中的溶血活性来评估乳腺的局部免疫力比血清的溶血能力更合适。然而，牛奶的溶血活性较弱，有时会发现其溶血活性接近检测下限，因为牛奶中存在的许多抑制剂掩盖了其低溶血活性，因此使用血清的溶血活性作为代表值。人类MBL2 基因外显子1 在胶原蛋白样结构域的点突变被发现与MBL-C 血浆浓度相关，但奶牛突变位点的任何标记基因型与溶血补体活性CH50 和ACH50 之间均未观察到显著相关性。

3 展望

识别遗传抗性动物的适当方法是研究宿主遗传学与乳腺炎易感性和抗性的关联，因此，遗传标记选择被确定为筛选遗传性乳腺炎抗性牛的最佳方法。免疫和炎症相关基因中突出的多态性可以被视为牛乳腺炎控制研究中的潜在生物标志物。现阶段对牛主要抗病候选基因的研究取得了一定的进展，但仍然存在具体遗传机制不明确，各种疾病的分子标记知之甚少的问题[25]。在育种时，通过传统的表型选择和分子标记辅助选择联合使用，两者互补，使其在抗病育种上产生最大的效益同时提高动物的抗病能力。

甘露糖结合凝集素是一类可溶性调理素，能够识别多种病原体，并在先天免疫反应中发挥重要作用。此外，MBL 通过其选择经典转化酶的能力，也能够激活补体。因此，结合遗传学和分子生物学的方法，进一步明确MBL 的SNP 对奶牛乳腺炎的抗病作用，在提高奶牛育种及生产经济效益等方面都具有重要意义。由于奶牛乳腺炎发病机制复杂，且致病因素多样化，针对MBL 与乳腺炎发病关系的研究，目前采用补充外源性MBL 维持免疫系统稳态，已成为一种新的研究策略。