牛结节性皮肤病的诊断防控研究

胡小慧，邓瑞雪，潘玉平，贾怀杰，安芳兰，刘学荣

（1.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州 730046；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州 730046）

牛结节性皮肤病病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV）在临床上引起牛结节性皮肤病（Lumpy skin disease，LSD），该病主要侵害牛科动物，以消瘦、皮肤水肿、淋巴结肿大、皮肤形成结节或溃疡、发热等症状为主[1]。LSD 潜伏期为28d，发病率2%～45%，感染牛死亡率可达20%[2]。健康牛群皮肤黏膜若有破损，在直接接触病牛破溃的皮肤后感染，LSD 也可通过媒介如被污染的饲养场所、节肢动物、鸟类，甚至饲养人员等进行机械传播[3]。目前研究显示LSDV 不感染人，但除牛科动物外，研究人员在长颈鹿、大羚羊等野生反刍动物体内也检出了LSDV 抗体，但并未进一步确诊它们是否感染[4]。发病动物出现的皮肤破损、母畜流产、产奶量下降等情况会给养殖户带来重大损失，已有研究表明，感染LSD 后造成的经济损失奶牛约为886.34 美元/头，而肉牛则更多，为1066.61 美元/ 头[5]。近年来，除LSD 的原始暴发地非洲大陆之外，LSD 在欧洲和亚洲也呈流行趋势，发病具有明显的季节性。2019 年8 月，第一例LSD 在我国新疆伊犁哈萨克自治州确诊，此后疫情迅速蔓延至国内其他多个省份。LSD 是世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health，OIE）法定报告的动物疫病之一，也是我国 《一、二、三类动物疫病病种名录》 中的二类传染病，目前国内尚无特效药物进行治疗，因此快速准确的诊断方法和疫苗免疫是防控LSD 的关键，本文对现有LSD 应用较为广泛的诊断方法及防控措施的研究进展进行阐述，为LSD 疫情的防控提供理论参考。

1 临床综合诊断

2019 年8 月我国首例LSD 病例在新疆确诊后，农业农村部工作组在当地开展流行病学调查、临床诊断和病理解剖等工作。通过现场和问卷调查发现，2019 年6 月至8 月，中哈边境牧民发现部分牛体型消瘦、皮肤出现疙瘩等类似LSD的症状。现场检查疑似病例，除LSD 特征症状外，病牛出现口鼻溃疡、食欲减退、不善活动等现象。剖检发现病牛内脏（心肝脾肺肾小肠等）及淋巴结普遍肿大、出血及胶冻样浸润[6]。临床综合诊断可初步确诊为LSD 疑似病例，王图雅等[7]研究发现，通过荧光PCR 和竞争ELISA 方法检测1 例表现临床症状的牛，但2 种方法检测结果均为阴性，因此不能将临床症状作为扑杀的唯一依据，应同时综合考虑其他检测结果。

2 实验室诊断

2.1 病毒分离鉴定

牛结节性皮肤病病毒分离鉴定可以采用细胞株或鸡胚进行，OIE 推荐使用羔羊睾丸细胞（lamb testis，LT）或羔羊肾细胞（lamb kidney，LK）进行病毒分离。除此之外，目前报道的能够增殖LSDV 的细胞主要有牛肾细胞（Madin-Darby bovine kidney，MDBK）、非洲绿猴肾细胞（African green monkey kidney，Vero）、原代绵羊睾丸细胞（Primary sheep testis cells，Primary ST）、绵羊睾丸细胞（Ovine testis cells，OA3.Ts）、绵羊胚胎皮肤细胞（Embryonic Skin of Sheep，Esh-l）等[8]。张敏敏等[9]采集了新疆伊犁地区发病牛的病变皮肤组织，通过组织研磨、PBS 洗涤、离心沉淀等操作后，取上清液接种LT细胞，对典型病变细胞培养物进行鉴定，透射电镜观察到大于200nm 的砖型粒子，与Moss 等[10]鉴定的LSDV 粒子大小（约290nm×240nm）基本一致。电镜观察病毒粒子大小只能初步判断为羊痘病毒属病毒，若想要确诊还需结合临床症状和其他检测方法进行。使用鸡胚接种病毒时，可采集绒毛尿囊膜（Chorioallantoic membrane，CAM）上的痘样病变组织进行PCR 检测[11]。

通过动物接种试验也可确定临床疫病是否由LSDV 引起，但所需时间较长，一般为4～7d，将病牛的新鲜结节制成乳剂[12,13]，皮下或皮内接种易感牛，待接种部位出现坚硬的疼痛性肿胀后，采集肿块和下层肌肉组织、脾脏、血液或唾液等进行病毒分离或核酸检测试验，若结果为阳性即可确诊。

生物安全是进行LSDV 病原分离试验和动物接种试验的前提，病毒分离必须在生物安全三级实验室（Animal Biosafety Level -3，ABSL-3）中进行，因此限制了该方法在临床中的应用推广。目前确诊大多采用免疫学或分子生物学诊断方法对抗体或病毒核酸进行检测。

2.2 免疫学检测

常规血清学方法主要用于检测患病动物体内的特异性抗体和感染性抗原，因此可用于检测LSD 流行地区的样品。

2.2.1 病毒中和试验

病毒中和试验（Virus neutralization test，VNT）是OIE 推荐的LSDV 检测方法之一。Samojlovic[14]开发的VNT 方法包含疫苗免疫后的血清抗体和MDBK 细胞培养的LSDV 毒株两部分，使用该方法和ELISA 方法同时检测200 份临床采集的奶牛血清和125 份已知的LSDV 阴性牛血清，结果显示：临床血清中VNT 法抗体阳性率为34%（68/200），ELISA 法抗体阳性率为30%（60/200）；已知血清中VNT 法抗体阳性率为0%（0/125），ELISA 法抗体阳性率为0.8%（1/125），说明该方法可用于临床血清样品LSDV抗体检测。

2.2.2 酶联免疫吸附试验

Carn 等[15]建立的捕获酶联免疫吸附试验（ELISA）法，包被绵羊痘KS-1 株P32 重组抗原与LSDV 抗体反应后能够检测到患病动物活组织中以及组织培养上清液中的山羊痘病毒（Capripoxvirus，CaPV），活组织抗原最早测得时间为感染后7d。Bowden 等[16]以羊痘病毒属的核心蛋白ORF095 和ORF103 为重组抗原构建的间接ELISA 方法能够检测到CaPV 感染后的血清抗体，人工感染条件下该方法敏感性和特异性分别为95%、97%，但疫苗免疫后敏感性仅为30%。Babiuk 等[17]共检测231 份山羊、绵羊和牛血清中的CaPV 抗体，发现间接ELISA 方法特异性和敏感性分别为95%和96%。Heine 等[18]基于痘苗病毒H3L 基因的同源基因P32 构建的间接ELISA 方法虽然有较高的特异性，但全长P32 基因的表达量较低，限制了该方法的使用。

2.2.3 免疫过氧化物酶单层分析法

Haegeman 等[19]建立的免疫过氧化物酶单层分析法（Immunoperoxidase monolayer analysis，IPMA）可用于检测牛血清中的LSDV 抗体。对LSDV 实验感染和自然感染的144 份牛血清样品进行检测，均检出阳性抗体，检测结果与病毒中和试验和商品化ELISA 试剂盒相一致，并且与BTV 和FMDV 感染的样品不发生交叉反应，可与稀释度1∶50 的牛血清发生反应，特异性和敏感性良好。

通过比较检测LSDV 的各种免疫学方法，主要不足之处如下：①VNT 法需要保证生物安全，对低抗体水平的动物检出率低，且该方法需要进行细胞培养，对操作人员和细胞要求较高。②各种ELISA 法虽然能够同时检出GTPV、SPPV 和LSDV 三种抗体，但无法进行具体细化鉴别。③蛋白质免疫印迹法操作复杂，不适用于田间推广应用。④间接免疫荧光抗体试验由于操作中对背景和细胞质的非特异性染色，会使判定结果受到主观性的影响。⑤琼脂凝胶免疫扩散试验敏感度较低，与副痘病毒存在交叉反应。

2.3 分子生物学检测

基于抗原抗体反应的免疫学诊断方法在调查群体感染情况时有一定的优势，但不能快速准确地确定个体是否感染。细胞免疫是机体应对痘病毒属病毒感染的主要形式，在感染或疫苗接种初期等抗体水平较低时抗体检测方法还有一定的局限性，鉴于传统的血清学试验敏感性较低、操作繁琐、耗费巨大、不能鉴别诊断CaPV 等各种限制，研究人员开发了具有更高特异性和敏感性的核酸检测技术。常用的基于分子生物学诊断的核酸检测技术主要有以下3 种。

2.3.1 聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应技术（PCR）是OIE 推荐的检测LSDV 的方法之一，一般发病后7～19d 可检测到LSDV 核酸片段，最长161d[20]。张敏敏等[9]对病变细胞液中提取的DNA 进行扩增，发现PCR 扩增所得的毒株LSDV/China/Xinjiang/2019与NCBI 中LSDV 相应片段的相似度为99.98%。羊痘病毒属病毒基因同源性高，可基于高保守核酸序列设计引物，建立CaPV 的通用检测方法。如Ireland 等[21]、Kitching 等[22]建立的通用型方法特异型好，与羊口疮和牛痘病毒均无交叉反应。

2.3.2 实时荧光定量PCR

除可以检测CaPV 的不同病毒外，实时荧光定量PCR（qPCR）的优势主要在于更早更快地检出拷贝数更低的核酸，并且可以鉴别诊断LSDV 野毒株和疫苗株，这对疫情防控有帮助。qPCR 包含染料法和探针法。原耀贤等[23]建立了基于染料法的qPCR，在检测重组质粒pMD19T-LSDV 时其敏感性比普通PCR 高100 倍，最低检测浓度为7.11x102copies/μL。与染料法相比探针法需要合成探针，较为昂贵，但特异性高于前者。孔玉方等[24]选取LSDV 的保守基因ORF71，设计的探针法qPCR 检出限为1.16 copies/μL，而聂福平等[25]、Eirini 等[26]、Das 等[27]基于不同的序列设计的探针法最低检出限分别为1.48、8 和10copies/μL。

2.3.3 其他方法

环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）可以在60～65℃下扩增病毒核酸，关于它在临床上的使用有两种看法。一种认为LAMP 的试验结果由是否观察到染料颜色变化来确定，具有一定的主观性[28]，另一种认为正是目测的便捷性使得该方法可以在基层推广使用[29]。重组酶聚合酶扩增法（RPA）可在45℃时对样品进行等温快速扩增，已用于临床检测SPPV 和GTPV[30]。高分辨率熔解曲线分析法依据4 种熔解曲线峰来鉴别诊断LSDV、GTPV以及SPPV 的野毒株和疫苗株[31]。

3 防控难点与建议

3.1 防控现状

依据相关规定，我国对LSD 疫情实行快报制度，相关单位接到疑似症状报告后，按照“可疑疫情—疑似疫情—确诊疫情”的程序，最终由省级人民政府畜牧兽医主管部门或农业农村部按照确诊结果和流行病学调查信息认定疫情。防控传染性疾病的三大有效措施为控制传染源、切断传播途径和保护易感动物。目前发生LSD 疫情后采取的主要措施如下：首先，对疫点内所有病牛、病原学阳性牛及其产品进行扑杀销毁并无害化处理，在疫区和受威胁区禁止牛只出入，并禁止未经检疫合格的牛皮张、精液等产品调出。其次，灭杀饲养场所内的虫媒等生物，清除滋生环境，对牛只排泄物、被病原污染的饲料和垫料、污水等物品进行无害化处理，对养殖场所、出入人员、车辆等设施设备进行消毒。最后可以使用山羊痘疫苗对疫情所在县和相邻县的全部牛只进行紧急免疫接种。由于LSD 主要发生于吸血虫媒活跃季节，给疫病的防控和净化增加了难度，鉴于LSD 疫情已经在我国多个省份发生，在继续维持边境防控和出入境检疫的基础上，需同时加强国内动物跨省调运监管。

3.2 病原方面

由于LSD 潜伏期长，疫情初期除有明显临床症状的牛之外，同群动物感染后不易被发现，如若漏诊，则存在疫情扩散的风险。LSD可以通过虫媒和非虫媒等多种途径传播，使得切断传播途径这一措施难以达到预期效果。因此，为提高LSD 防控技术水平，除常规的驱蚊灭蝇措施外，建议完善现有的疫病确诊技术，开发可以早期监测牛群群体水平LSDV 的工具，加快推进疫苗和养殖场灭蜱虫药物的研发[32]，以此来提高LSD 防控效率。虽然弱毒活疫苗的免疫保护效果比灭活疫苗好，但目前对于LSDV 的致病机制和疫苗免疫机制尚不清楚，进而导致了疫苗株和野毒株重组病毒的出现，这使得活疫苗免疫在临床应用时存在隐患。袁歆玮[33]等提出，应加强LSDV 致病机制和免疫机制研究，这对于研发新的抗病毒疫苗和药物以及鉴别诊断试剂的靶标等工作都有重要意义。

3.3 人员方面

牛结节性皮肤病的易感动物牛类既存在于规模化养殖场，也存在于农村散养。规模化养殖场具有较为完善的养殖模式和生物安全体系，而农村散养存在防疫意识薄弱、专业技术人员欠缺、交易频繁多样以及病牛扑杀补偿较低等诸多问题。鉴于以上情况，一是要提高养殖户和基层防疫人员对LSD 疫情的认知，有关部门要加大宣传力度，组织知识科普和法律法规培训，提升从业人员的群防群控意识和法律意识，严厉打击贩卖病死牛等行为[34]，对病牛要严格实行无害化处理措施。二是要加强对各动物疫病预防控制机构和动物卫生监督机构工作人员的技术培训，使其能够快速准确处置临床病例，提升工作效率。三是要加强活牛的调运管理，经过严格的风险评估后进行引种或购入新牛，定期排查疫情隐患，做好疫情监测工作。四是明确病牛无害化处理补偿标准，为在疫情最早期扑杀动物的养殖户适当提高补偿金额，强化疫情报告制度，让养殖户在发现疫病后按真实情况及时上报，在一定程度上降低防控难度[35]。

4 小结

疫情发展初期，牛对LSDV 敏感，可采用特征性临床症状进行初步诊断，同时结合各种PCR技术检测核酸进行确诊。疫情发展中期，可采用多种免疫学方法检测LSDV 抗体进行诊断。疫情发展后期，可能存在隐性感染或感染免疫情况，病牛体表皮肤症状不明显，且由于抗体存在，机体病原含量下降，此时PCR 技术有可能无法扩增出LSDV 核酸片段，为避免漏诊造成疫情扩散等情况，应联合使用血清学方法和分子生物学方法，并开发新的诊断技术。对于LSD，应遵循预防为主，防治结合原则，在准确诊断、防止疫区动物转移的同时，应积极开发杀蜱药物，切断传播途径，同时加强易感动物疫苗接种，积极预防，保障人和动物健康。