PCR 系列技术在中药种属及品质鉴定中的应用

王 卿，周新宇

（江苏省无锡市中医医院药学部，江苏 无锡 214000）

中药是传统医学的重要组成部分，它们通常由复杂的天然植物和动物组成，具有多样的化学成分。传统的中药鉴定方法主要基于形态学﹑化学成分分析和药效评估等传统方法，但这些方法存在着一定的局限性。近年来，PCR 技术的广泛应用为中药鉴定提供了新的机会。PCR技术可以通过放大目标DNA 序列来检测中药样品，并且具有高灵敏度﹑高特异性和高重复性等优点。

1 PCR 技术原理

PCR 技术是一种体外DNA 扩增技术，它包括三个关键步骤：变性﹑引物结合和延伸。PCR 技术利用DNA聚合酶的热稳定性，反复进行高温变性﹑引物退火和延伸反应，从而在无须细胞和基因库的条件下，快速产生大量目标DNA 序列[1]。

1.1 PCR-RFLP 技术

PCR-RFLP（聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性）技术是一种用于分子鉴定和检测样品中掺杂成分的方法，它结合了PCR 技术和限制性内切酶酶切分析，可以实现对样品的半定量检测。

有研究指出[2]，在PCR 反应中使用这些DNA 模板进行扩增，并选择适当的限制性内切酶进行酶切，由于川贝母和伪品具有不同的DNA 序列，限制性内切酶在两者中会产生不同长度的DNA 片段。这些片段通过凝胶电泳进行分离和可视化。最后，研究人员使用专业的软件来分析凝胶电泳图像上的条带强度，通过比较川贝母样品与不同掺伪比例样品的条带强度，来计算掺伪量的大致比例。这种方法直观地提供了掺假﹑掺伪样品的半定量结果[3]。

1.2 PCR 常常结合其他技术

有研究指出[4]，在实际应用中，PCR 常常结合其他技术进行综合分析，以提高鉴定的准确性和可靠性。除了基本的PCR 技术，还有一些快速﹑小样本﹑高通量的技术在中药种属及品质鉴定中得到广泛发展和应用，包括基因芯片﹑一代测序（结合有中药指纹技术）和新一代测序（NGS）技术。

还有研究指出[5]，基因芯片技术是一种高通量的DNA 分析方法，可以同时对上千个DNA 序列进行扩增和检测。通过使用特定的DNA 探针，基因芯片可以检测中药材中大量的基因信息，从而实现种属的鉴定和品质分析。

一代测序技术结合了中药指纹技术，可以对中药材中的多个成分进行快速﹑高效的检测。与传统的色谱分析相比，一代测序技术具有更高的灵敏度和分辨率，能够更全面地评估中药材的品质[6]。

NGS 技术是一种高通量测序技术，可以同时对大量的DNA 序列进行测序。在中药种属及品质鉴定中，NGS 技术可以通过扩增和测序中药材中的DNA 条形码或指纹图谱，从而实现对中药材种属的准确定量分析[7]。

综上所述，除了基本的PCR 技术之外，结合基因芯片﹑一代测序和NGS 等高通量技术，可以更全面﹑快速地进行中药种属及品质鉴定。这些技术的发展和应用将有助于提高中药材的品质控制和质量评估。

2 PCR 技术在中药鉴定中的应用案例

2.1 DNA 条形码技术

DNA 条形码技术是一种基于PCR 技术的分子鉴定方法，通过特定引物扩增中药材DNA，并对扩增产物进行测序和比对，以识别中药材的物种来源。

研究显示[8]，对于常用的中药材川芎，由于其形态特征与其他相似植物相近，传统的形态学鉴定方法存在一定的局限性。因此，研究者利用DNA 条形码技术来准确鉴定川芎。选择合适的DNA 条形码区域作为PCR引物，这通常是一段高度保守的DNA 片段。然后，从川芎样品中提取总DNA，利用PCR 技术将目标区域扩增出来。扩增产物经纯化后进行测序，得到DNA 序列。将得到的DNA 序列与已知物种的DNA 条形码数据库进行比对，通过比对结果可以确定川芎的物种来源。如果比对结果与某一物种完全匹配，即可确认川芎为该物种。

因此，通过DNA 条形码技术，可以在分子水平上对中药材进行准确的鉴定，避免了传统鉴定方法的主观性和不确定性。此外，DNA 条形码技术还可以应用于中药材的质量控制﹑真伪鉴别以及市场监管等方面。

2.2 种质资源保护

种质资源保护是一种重要的措施，旨在保护和维持中药材的遗传多样性，以确保其可持续利用。PCR 技术在中药鉴定中的应用案例之一就是通过对中药材的遗传多样性进行PCR 分析，评估并保护中药材的种质资源，并为中药的合理开发和利用提供科学依据。

研究指出[9]，通过PCR 技术，可以利用特定的引物扩增中药材的DNA 样品，并通过分析扩增产物的多态性来评估中药材的遗传多样性。例如，研究者可以选择适当的微卫星标记或SNP 标记作为PCR 引物，对中药材不同个体或不同地理种群的DNA 进行扩增。

相关研究表明[10]，PCR 可以通过特异性引物扩增中药材基因组中与种属相关的DNA 区域，从而确定中药材的种属。例如，在种植中药材中，可以使用基于PCR的DNA 条形码技术，如ITS（Internal Transcribed Spacer）序列和rbcL（Rubisco Large Subunit）等，进行种属鉴定。

PCR 可以用于检测中药材遗传变异，评估中药材的遗传多样性和品质稳定性。通过比较不同采集地﹑不同品种或不同批次的遗传差异，可以对中药材质量进行评估。

PCR 可以用于鉴定中药材的真实性和纯度。通过检测特定基因或DNA 区域，可以判断中药材是否含有其他植物成分或掺杂物，从而确保中药材的质量和安全性。

PCR 可以结合其他分析方法，如定量PCR﹑实时荧光PCR 和基因表达分析等，用于评估中药材中活性成分的含量和表达水平。这有助于控制中药材的品质，并为临床应用提供科学依据。

综上所述，PCR 技术在中药鉴定中的应用之一是通过对中药材的遗传多样性进行PCR 分析，评估并保护中药材种质资源，为中药的合理开发和利用提供科学依据。

2.3 中药真伪鉴定

中药真伪鉴定是保证中药材质量和安全的重要环节。PCR 技术在其中也扮演着关键的角色，通过扩增和分析目标基因，可以准确地鉴定中药材真伪，并识别掺假品种。

一些研究指出[11-12]，中药真伪鉴定利用PCR 技术对中药材中的特定基因进行扩增和分析。这些基因通常与中药材的特征性成分﹑药效或生物学特性相关。确定用于真伪鉴定的目标基因，该基因应具有以下特点：与中药材的真实性密切相关﹑在核酸水平上稳定存在﹑易于扩增和分析等。从待鉴定的中药材样品中提取总DNA，并使用PCR 技术扩增目标基因。PCR 扩增引物的设计至关重要，需要确保引物的特异性和扩增效率。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他相关技术，对PCR 扩增产物进行分离和检测。通过比对待鉴定样品的PCR 产物与已知真品和假品的PCR 产物，可以确定中药材的真实性。还可以采用其他分析方法，如DNA 测序﹑限制性片段长度多态性（RFLP）分析﹑单核苷酸多态性（SNP）分析等来进一步确认中药材的真伪。通过PCR 技术进行中药真伪鉴定具有高度的准确性和灵敏性。它可以有效地检测掺假品种，避免因掺杂其他植物材料或低质量替代品而导致中药材的质量下降或药效减弱。通过PCR 技术对目标基因进行扩增和分析，可以准确地鉴定中药材的真伪，并识别掺假品种，从而保障中药材的质量和安全。

3 PCR 技术在中药鉴定中应用的挑战和未来发展方向

在中药鉴定中，PCR 技术虽然具有许多优势，但也面临一些挑战。其中一个重要的挑战是制定和建立统一的检测方法和标准，以确保PCR 技术在中药鉴定中的可靠性和准确性。

制定和建立统一的PCR 检测方法和标准是关键。这包括选择适当的引物和探针，确定合适的PCR 条件和参数，标准化扩增产物的分离和检测方法等。通过建立统一的标准化流程，可以提高PCR 结果的可重复性和可比性。选择合适的引物和探针对于PCR 的成功至关重要。针对中药材的鉴定，需要设计特异性高﹑能够扩增目标基因的引物和探针。此外，还可以利用基因组学数据和生物信息学工具来辅助引物和探针的设计，提高其特异性和灵敏度。

中药材样品通常经过炮制﹑干燥等处理，其中可能存在DNA 的降解或污染。因此，有效的样品预处理方法对于PCR 鉴定的准确性至关重要。开发适合中药材样品的DNA 提取和纯化方法，可以最大限度地提高PCR 结果的准确性。建立中药材的DNA 序列数据库和参考标本库可以为PCR 鉴定提供参考。这些数据库可以包含已知的中药材的DNA 序列信息，以及其他相关信息，如产地﹑鉴定方法等。通过与这些数据库比对，可以更准确地确定待鉴定样品的真实性。除了传统的PCR 技术外，还可以结合其他分子生物学技术和高通量测序技术，进行更全面和深入的中药鉴定。例如，利用单核苷酸多态性（SNP）分析﹑基因组学﹑转录组学等技术，可以进行中药材遗传多样性分析，从而更准确地识别和鉴定中药材的真伪。

综上所述，应对PCR 技术在中药鉴定中应用的挑战需要制定和建立统一的检测方法和标准，进一步改进引物和探针设计，优化样品预处理方法，建立数据库和参考标本库，以及结合其他新技术的应用。PCR 及其相关技术在中药种属鉴定方面具有很高的特异性和准确性，可以快速且可靠地确定药材的种属。然而，在药效鉴定以及原产地鉴定方面，PCR 技术的应用确实存在一些限制。药效鉴定是评估中药材药理作用和疗效的一个重要方面。传统的药效鉴定往往需要综合考虑多个因素，如中药材中的多个活性成分的含量﹑它们之间的相互作用等。虽然PCR 技术可以用于对中药活性成分相关基因的检测和表达研究，但药效鉴定通常需要更加复杂的实验方法和数据分析手段来进行准确评估。至于原产地鉴定，目前的技术并不能完全满足要求。虽然PCR 技术可以在一定程度上帮助确定中药材的种属，但对于精确的原产地鉴定来说，还需要结合其他辅助手段，如同位素分析﹑化学成分分析等。这些方法可以从不同的角度揭示中药材的产地信息，提供更全面准确的鉴定结果。

尽管PCR 及其相关技术在中药种属鉴定方面具有优势，但在药效鉴定和原产地鉴定方面仍存在一定的局限性。为了得到更全面﹑准确的结果，需要结合其他技术手段进行综合分析，并不断推进相关研究和方法的发展。

4 结论

PCR 技术在中药鉴定中具有广阔的应用前景。通过使用PCR 技术，可以快速﹑准确地鉴定中药样品，并保护中药的品质和安全性。然而，PCR 技术在中药鉴定中应用仍面临一些挑战和限制，需要继续改进和发展。未来的研究方向包括标准化PCR 检测方法﹑结合新兴基因组学技术的应用以及建立大规模中药数据库等。这些努力将有助于推动中药鉴定领域的发展，并为中药的研究和开发提供更多的支持。