植物乳杆菌发酵提取未成熟琯溪蜜柚果实果胶工艺优化

丁红霞 杨远帆,2,3 黄淑安 倪 辉,2,3

柚类水果是中国南方广泛种植的水果之一。其中,琯溪蜜柚是福建省平和县种植量最大的水果之一。自2015年以来,琯溪蜜柚年产量超过120万t,年出口量超过14万t[1]。在柚类水果种植过程中会有大量未成熟柚类果实(immature pomelo fruit,IPF)产生,约占柚类水果总生产量的20%～50%[2]。这些残次果不仅造成巨大的资源浪费,还会污染环境。有研究表明,IPF中含有较高的精油[3]和果胶[4]。其中,果胶是一种存在于植物组织中的复合杂多糖,因具有独特的凝胶特性被广泛应用于食品、药品等领域,这可能是未成熟柚类果实潜在的有效利用途径。

目前,工业上主要采用酸碱法进行果胶提取,但酸碱溶液易腐蚀提取设备,并对环境产生不利影响[5]。研究表明,酵母菌[6]、乳酸菌[7]、曲霉[8]等微生物同样可以用于植物果胶提取。发酵法提取果胶是利用微生物代谢产生的酶和酸类物质破坏植物细胞壁,从而释放出果胶类物质[9],具有反应条件温和、耗能低、环境污染低等优点[10]。从目前来看,有关微生物发酵法提取果胶的研究尚未应用至柚类水果的未成熟果实中。乳酸菌在发酵过程中会产生乳酸等酸性物质[11],酸性物质可将植物中非可溶性果胶转化为可溶性果胶,从而促进果胶的溶出[12],同时,乳酸菌在发酵时会产生果胶酶,也可有效促进植物组织中的果胶提取[13-14]。此外,植物乳杆菌等乳酸菌发酵提取的果胶多糖具有较好的结构和理化性质[15]。

研究拟以果胶提取率为指标,对植物乳杆菌发酵未成熟琯溪蜜柚果实提取果胶的工艺参数(接种量、发酵时间及液料比)进行优化,并分析植物乳杆菌发酵提取果胶的性质,旨在为利用未成熟柚类果实生产果胶提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

未成熟琯溪蜜柚果实:未成熟琯溪蜜柚果实切片后于60 ℃烘干、粉碎,过60目筛备用,福建省平和县农业技术推广站;

乳酸菌菌粉:含有1×1010CFU/g的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum),山东中科嘉亿生物工程有限公司;

MRS肉汤:广东环凯微生物科技有限公司;

浓硫酸、无水乙醇:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;

咔唑:分析纯,上海麦克林生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平:ME104E/02型,梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司;

酶标仪:Epoch 2 T型,美国伯腾公司;

生化培养箱:ZWYR-2102型,上海智城分析仪器制造有限公司;

双人单面超净工作台:SW-CJ-2FD型,苏州净化设备有限公司;

立式压力蒸汽灭菌器:YXQ-LS-30SH型,上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 果胶提取工艺 精确称取一定量的原料与蒸馏水混合后装入三角瓶中,用16层纱布及牛皮纸封口,121 ℃灭菌15 min。将植物乳杆菌粉于MRS肉汤培养液中37 ℃活化,制得植物乳杆菌悬浮菌液,按照一定的接种量(以体积量计)接种到灭菌的原料中,混匀,37 ℃静置发酵一定时间。

1.3.2 单因素试验

(1) 接种量:固定发酵时间24 h,液料比20∶1 (mL/g),分别选取接种量为8%,10%,12%,14%,16%(以体积量计)进行试验,确定最佳接种量。

(2) 发酵时间:固定接种量12%,液料比20∶1 (mL/g),分别选取发酵时间为12,24,36,48,60 h进行试验,确定最佳发酵时间。

(3) 液料比:固定接种量12%,发酵时间24 h,分别选取液料比为10∶1,15∶1,20∶1,25∶1,30∶1 (mL/g)进行试验,确定最佳液料比。

1.3.3 正交试验设计 在单因素试验基础上,以果胶提取率为考察指标,对接种量、发酵时间和液料比进行三因素三水平正交试验,采用L9(34)正交试验进一步优化IPF果胶提取工艺参数。

1.3.4 果胶提取率测定 采用硫酸咔唑比色法[16]。以吸光度为纵坐标,半乳糖醛酸标准溶液质量浓度为横坐标,绘制标准曲线y=0.006 4x+0.005 9,R2=0.996 9,并按式(1)计算果胶提取率。

(1)

式中:

Y——果胶提取率,%;

c——标准曲线上的半乳糖醛酸质量浓度,μg/mL;

m1——烘干的果胶质量,g;

m2——称取的果胶样品质量,g;

M——样品质量,g。

1.3.5 理化指标测定

(1) 酯化度:参照Silva等[17]的方法并修改。取0.1 g样品加少量无水乙醇湿润后溶于20 mL蒸馏水中,35 ℃水浴2 h,用0.1 mol/L NaOH调pH至8.2,加入10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液静置2 h,加入10 mL 0.1 mol/L HCl溶液,用0.1 mol/L NaOH调pH至8.2,按式(2)计算果胶酯化度。

(2)

式中:

R——酯化度,%;

V1——第一次滴定NaOH溶液消耗体积,mL;

V2——第二次滴定NaOH溶液消耗体积,mL。

(2) 持水性和持油性:参照Saeidy等[18]的方法并修改。取0.1 g样品于离心管中,加入20 mL蒸馏水(或10 mL花生油),混匀搅拌1 min,8 000 r/min离心10 min,除去上清液,记录离心管与样品总质量,按式(3)计算持水性和持油性。

(3)

(4)

式中:

X1——持水力,g/g;

X2——持油力,g/g;

m1——样品质量,g;

m2——样品吸水前质量,g;

m3——样品吸水后质量,g;

m4——样品吸油前质量,g;

m5——样品吸油后质量,g。

(3) 蛋白质含量:参照Aklilu等[19]的方法。

(4) 乳化性和乳化稳定性:参照Saeidy等[18]的方法。

1.4 数据处理

所有试验均重复3次,采用Excel和SPSS 19.0软件对数据进行处理及制图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 接种量对果胶提取率的影响 由图1可知,随着植物乳杆菌接种量的增加,果胶提取率呈先上升后下降再逐渐趋于平缓的趋势。当接种量为12%时,果胶提取率达最大(8.10%)。继续增大接种量,果胶提取率下降,可能是接种量过多,发酵底物中的营养物质被消耗殆尽,不足以维持菌种生长、产酶及产酸,从而导致果胶提取率下降[20]。因此,接种量取12%左右进行正交试验。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.1.2 发酵时间对果胶提取率的影响 由图2可知,发酵初期,果胶提取率随发酵时间的延长有一定增加,发酵至24 h时果胶提取率(9.08%)达最大;随后果胶提取率趋于平稳。在乳酸菌发酵提取贡水白柚皮膳食纤维中也存在类似现象[21],可能是发酵初期乳酸菌产生了一定量的酶和酸,促进果胶释放,而24 h后发酵底物中营养物质逐渐被消耗,菌种生长及产酸能力下降,从而导致果胶提取率下降[22-23]。因此,发酵时间取24 h左右进行正交试验。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.1.3 液料比对果胶提取率的影响 由图3可知,随着液料比的增加,果胶提取率呈先上升后趋于平稳的趋势。当液料比>20∶1 (mL/g)时,果胶提取率稳定在8.31%左右。植物乳杆菌发酵过程中,会产生一定量的酶和酸,随着液料比的增加,发酵液中各营养物质将达到最适发酵浓度,促进酶与酸的产生,从而增强与柚子果实的作用,果胶提取率提高;但液料比增加到一定程度时,发酵液中的酸与酶对柚子果实的作用达到平衡,增加液料比,果胶提取得率不会再增加[22]。因此,液料比取25∶1 (mL/g)左右进行正交试验。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2 正交优化试验

根据单因素试验结果,选择合适的参数范围进行正交试验优化,试验因素水平见表1,试验设计及结果见表2。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验设计及结果

由表2可知,最佳的发酵条件为接种量14%,液料比25∶1 (mL/g),发酵时间12 h;各因素对果胶提取率的影响由大到小依次为料液比>发酵时间>接种量。

植物乳杆菌发酵未成熟琯溪蜜柚果实提取果胶的最优工艺条件为接种量14%、料液比25∶1 (mL/g)、发酵时间12 h,在此条件下进行3次平行验证实验,测得果胶平均提取率为11.60%,与表2中最大果胶提取率相似。

2.3 未成熟琯溪蜜柚果实果胶性质分析

经检测,采用植物乳杆菌发酵法提取的未成熟琯溪蜜柚果实中果胶的半乳糖醛酸含量为26.13%、酯化度为68.58%、蛋白质含量为1.57%、持水性与持油性分别为0.53,7.01 g/g、乳化性以及乳化稳定性分别为14.33%和33%。检测数据表明,IPF果胶属于高酯化度果胶,根据高酯化度果胶对酸度(pH<3.5)和糖度(>55%)的要求,该IPF果胶可应用于果酱、糖果以及酸奶等食品工业。持水性与持油性主要受果胶密度及表面微观结构等特性影响,在食品工业用于改善产品的硬度和黏度[24]。IPF果胶的持水性与持油性略高于Muoz-Almagro等[25]提取的浆果果胶,可能是发酵过程中产生的酶作用于IPF中的果胶,使其结构被破坏,呈疏松多孔状,从而增大了水或油与果胶的接触面积,因此持水性和持油性增大[26];IPF果胶中蛋白质含量符合粮农组织的建议(<15.6%),其乳化活性和乳化稳定性低于李扬[27]提取的狐臭柴叶片果胶,可能与蛋白质含量会影响果胶的乳化性能有关[28]。

3 结论

利用植物乳酸菌发酵提取未成熟琯溪蜜柚果实中的果胶,其最适提取工艺条件为乳酸菌接种量14%、液料比25∶1 (mL/g)、发酵时间12 h,此条件下果胶提取率为11.60%,半乳糖醛酸含量为26.13%、酯化度为68.58%、蛋白质含量为1.57%、持水性与持油性分别为0.53,7.01 g/g、乳化活性以及乳化稳定性分别为14.33%和33%。试验仅探究了发酵因素对果胶提取率的影响,后续可以对果胶的其他性质如凝胶性、热稳定性或结构等进行深入分析。