卟啉壳聚糖共聚物的合成及其光动力抗肿瘤性能

何裕良,郑嘉琪,刘秋裕,莫雅通,梁惠婷,袁安琪,史 蕾*,张 召

(1.广东第二师范学院 化学与材料科学学院,广东 广州 510800; 2.江西师范大学 国家单糖化学合成工程技术研究中心,江西 南昌 330022 3.广东医科大学 生物化学与分子生物学教研室,广东 湛江 524023;)

光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)是一种新兴的治疗方法,其原理是在特定光源的激发下,光敏剂从基态跃迁至第一激发态,通过系间跃迁至三重激发态,从而产生具有强氧化性的活性氧(ROS)或单线态氧(1O2),进而杀死肿瘤细胞[1-2]。研究发现:PDT主要通过直接杀伤、使血管闭合进而使肿瘤细胞缺氧、激活T细胞引发免疫反应3种方式来对肿瘤细胞进行杀伤[3]。PDT有着组织选择性良好、创伤小、毒性低和灵活性好等优点,成为治疗恶性肿瘤和微生物感染的新型疗法[4]。

卟啉类化合物是一种具有18π电子的大共轭骨架的大环分子,π电子易在环内流动,因而表现出独特的物理化学及光化学性质[5],有着分子催化[6]、光捕捉[7]和电子转移[8]等功能,在催化化学、分析化学[9]、药学[10]、光电化学[11]和分子器件[12]等领域有着广泛的应用前景,是一种理想的光敏剂。

KELLY等[13]在1976年首次用一种血卟啉衍生物成功治疗5例膀胱癌。经过近半个世纪的发展,卟啉类化合物已经在临床上得到应用。2001年,美国食品与药品监管局批准维替泊芬(苯并卟啉衍生物单酸环A)用于治疗黄斑变性[14],由我国第二军医大学研制的血卟啉单甲醚已应用于脑胶质瘤和鲜红斑痣的临床治疗[15]。华卟啉钠(DVDMS)可用于治疗晚期食管癌,是我国最早进入光动力抗肿瘤治疗临床研究的光敏剂,目前已经到了III期临床试验阶段[16-17]。虽然PDT已经得到了学术界的广泛关注,但光敏剂数量较少的问题对PDT的发展造成了很大的限制[18],因此,需要开发更多的光敏剂以推动PDT的基础研究和临床应用。

目前,光敏剂已经发展到了第三代,其设计思路主要是引入具有生物活性的分子,如糖、蛋白质和纳米粒子等,从而增强光敏剂的生物相容性、水溶性和靶向性等性能,进而增强其PDT效力[19]。张海元等[20]通过热收缩高分子[P(NIPAM-co-AM)]将锌卟啉(ZP)连接于Bi2S3纳米棒表面,形成BPZP和ZP可削弱细胞抗氧化的能力,进而增强PDT效力。刘筱阳等[21]将一种凋亡蛋白酶—半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的多肽底物DEVD与卟啉结合,提升了光敏剂的光敏活性,能诱导细胞更深度的凋亡。同时,因为凋亡蛋白的存在,在经过光/药物诱导后,卟啉光敏剂能更为集中地聚集在线粒体的周围,组织选择性得到改善,实现对口腔癌细胞的协同杀灭。姜建壮等[22]设计了一种具有良好生物相容性和光活性的纳米粒子(NPs),其由氨基卟啉(m-TAPP)与短肽(Fomc-L3-OMe)共组装形成,NPs在低pH值的肿瘤微环境中带正电,可与带负电的癌细胞核糖体靶向结合,从而在肿瘤干细胞(CSC)中扩散,在光照条件下实现对CSCs的靶向杀伤。

羧甲基壳聚糖(CMC)是一种天然的两性聚电解质多糖,有着良好的生物相容性、生物降解性和低毒性[23-25],其羧基和氨基赋予了其接枝其它分子的可能,通过化学修饰等手段,可在保留其良好的生物相容性等优点的同时赋予其新的性能,是一种理想的药物载体[26],在药物研发方面有着可观的发展前景。

基于第三代光敏剂的设计思路,本文采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)组成的EDC/NHS体系,催化5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉(TAPP)与CMC通过酰胺键结合,使二者发挥各自的优势,以增强PDT效力。采用UV-Vis、IR、XRD与TGA表征化合物的结构,采用SEM观察化合物的微观结构,并测试了其光动力抗肿瘤性能。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津UV-Vis 2450型紫外可见分光光度计;布鲁克Aensor 27型傅里叶红外光谱仪;布鲁克Advance型X射线衍射仪;铂金埃尔默TGA 4000型热重分析仪;泰思肯mira 3型场发射扫描电镜;光照培养箱(LED光源,光照度4000 Lux)。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺(98%),阿拉丁;羧甲基壳聚糖,源叶生物;5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉(98%),吉林中科研伸科技有限公司;N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇、二甲基亚砜,分析纯,天津市大茂化学试剂厂;肝癌HepG2细胞、肝癌MHCC-97L细胞,American Type Culture Collection。

1.2 合成

称取0.0011 g的CMC于50 mL离心管中,加入0.016 mmol·L-1的EDC溶液和0.004 mmol·L-1的NHS溶液各1 mL,待CMC充分溶解后,磁力搅拌30 min进行活化。称取0.0067 g的TAPP,用1 mL的DMF溶解后滴入活化完成的CMC溶液中,然后在避光条件下磁力搅拌反应48 h,得到难溶于水、DMF和乙醇的絮状物。用无水乙醇洗涤絮状物,在4000 r/min的转速下离心,再吸出上层洗液,直至上清液呈浅黄色,且洗液在365 nm的紫外灯照射下仅存淡淡荧光,用紫外可见光谱检测,直至不出现TAPP的吸收峰。最后在真空干燥箱中常温且避光去除残余洗液[27-28]。合成路线如图1所示。UV-Vis(DMF∶EtOH=1∶1,V∶V)λmax:432,524,570,600 nm; IR(KBr)ν:3421,3354,3215,2950,1670,1610,1400,736 cm-1。

图1 TAPP-CMC的合成路线

1.3 光动力抗肿瘤活性测试

实验细胞为HePG2细胞,MHCC-97L细胞,以及HK2细胞。孔板中分布有2×105个细胞,将其置于培养箱中培育12 h。吸取培养基,加入TAPP-CMC悬浊液,在5 W、625 nm的红光下照射1 h,光照距离为15.5 cm。对照组细胞不做处理。培养23 h后弃去培养基,用PBS洗涤细胞3次,最后于倒置荧光显微镜中观察并对比细胞形态。

2 结果与讨论

2.1 化合物的表征分析

(1) 紫外光谱分析

如图2所示,卟啉类化合物在300～400 nm会出现明显的Soret吸收,500～700 nm的Q带也有较弱的吸收。用(EtOH∶DMF=1∶1,V∶V)作为溶剂,观察TAPP和TAPP-CMC的紫外谱图可发现,TAPP-CMC的最大吸收峰出现在432 nm处,在500～700 nm处也出现了Q带的吸收,相对于TAPP未发生显著变化,但吸收强度大幅降低,这表明CMC的引入没有破坏卟啉环的共轭结构,二者结合后可能发生了电子转移。

λ/nm

(2) 红外光谱分析

采用KBr压片法对CMC、TAPP和TAPP-CMC进行红外光谱表征,结果如图3所示。CMC的-NH2中的N—H键的伸缩振动峰出现在3400 cm-1,1606 cm-1、1419 cm-1和1060 cm-1分别对应-COOH的C=O键、C—O键和O—H键的伸缩振动峰[29-30]。TAPP的-NH2的对称和不对称伸缩振动峰分别出现在3448 cm-1和3427 cm-1,卟啉环的N—H键的特征峰出现在3300 cm-1和966 cm-1,N—H键的弯曲振动峰和摇摆振动峰分别出现在1604 cm-1,804 cm-1处对应-NH2的摇摆振动峰[31-33]。

ν/cm-1

在TAPP-CMC的红外谱图中,原本出现在1060 cm-1处的-COOH的伸缩振动峰消失,在3421～3354 cm-1出现了酰胺I带伸缩振动峰,3215 cm-1处为N—H键的伸缩振动峰,1670～1610 cm-1出现了酰胺II带的伸缩振动峰,1400 cm-1附近出现了C—N键的伸缩振动吸收带,在736 cm-1附近出现了伯酰胺的摇摆振动吸收宽峰。由此可推断,CMC与TAPP通过酰胺键结合。

(3) 热重分析

通过热重分析来表征化合物的热稳定性。图4为CMC、TAPP和TAPP-CMC的TG和DTG曲线。CMC的热稳定性较差,其热重分析过程存在3个失重过程,第1个阶段是30～240 ℃,对应吸附水和结合水的散失;第2个阶段是240～320 ℃,其失重速率和失重均为最大,应为分解阶段;第3个阶段是320～530 ℃,失重较为缓慢。530 ℃时基本不再失重。800 ℃下的失重率为35.30%。TAPP具有较好的热稳定性,仅在450～690 ℃出现了明显的失重,800 ℃的失重率为40.00%。

Temperature/℃

2θ/(°)

TAPP-CMC的热稳定性介乎TAPP和CMC之间,热失重行为与TAPP相似,出现在330～510 ℃。结果表明:TAPP与CMC通过酰胺键结合,CMC的引入没有破坏卟啉的大环结构。

(4) XRD分析

对CMC、TAPP和TAPP-CMC进行X射线粉末衍射表征,结果如图5所示。CMC在2θ为21.8°、17.3°、20.0°、20.09°和34.7°分别出现了特征峰。TAPP在20°时出现了较宽的特征峰,这表明二者均有一定的晶体结构。TAPP-CMC的衍射峰不仅保留了CMC的特征峰,也保留了TAPP20°的较宽的特征峰,说明TAPP与CMC的结合均保留了各自的规整结构,二者的结合通过酰胺键的生成来实现[32]。

(5) SEM分析

图6为CMC和TAPP-CMC的扫描电镜图。CMC主要呈现出不规则的碎片形貌,粒径尺寸为100 μm～700 μm。TAPP-CMC主要呈现不规则的块状碎片,粒径尺寸为4.5 μm～350 μm。

图6 CMC(a,b,c)和TAPP-CMC(d,e,f,g)的SEM照片

2.2 光动力抗肿瘤活性分析

图7为加药后HePG2、MHCC-97L以及HK2的细胞形态变化图。在加药后,细胞形状变得不规则,开始逐渐皱缩,说明细胞呈现出凋零的态势。结果表明:TAPP-CMC对肝癌HePG2和MHCC-97L细胞均具有光动力抗肿瘤的活性。此外,TAPP-CMC对肝正常细胞HK2也具有一定的光动力抗肿瘤的活性,说明其光敏副作用也存在。

图7 加入TAPP-CMC药液并给予光照培养后HePG2、MHCC-97L以及HK2的细胞形态变化

3 结论

基于第三代光敏剂的设计思路,本课题设计了一种卟啉-壳聚糖共聚物,用UV-Vis、FT-IR、XRD和TGA表征化合物的结构,用SEM观察了其微观形貌,通过观察肿瘤细胞形态图研究了该化合物的光动力抗肿瘤活性。结果表明:设计出了一套可行的卟啉-壳聚糖共聚物的合成方案,利用相关表征证明该合成方案能合成出目标化合物;首次发现TAPP-CMC共聚物具有一定的光动力抗肿瘤活性;通过对比发现,TAPP与CMC的结合保持了二者的主要结构,有利于二者发挥各自的优点。基本符合分子设计的初衷,为新一代光敏剂的开发提供实验依据和理论参考。