应用噬菌体展示随机12肽库筛选诺如病毒抗原模拟表位

周飞园 王璐△ 梁芷妍 林璧慧 李佳恒 王宇 井多娜 张绪富 戴迎春

（1.南方医科大学公共卫生学院流行病学系，广州 510515；2.南方医科大学中医药学院，广州 510515）

诺如病毒（Norovirus，NoV）是导致非细菌性胃肠炎散发及暴发的主要病原体，约占全球急性胃肠炎发病率的1/5［1］。NoV属于杯状病毒科，是单股正链小RNA病毒，全长7.5～7.7 kb，由3个开放阅读框（open reading frames，ORFs）组成，分别为ORF1、ORF2和ORF3，其中ORF2编码主要衣壳蛋白（major capsid protein，VP1）。VP1包括衣壳区（shell domain，S）和突出区（protruding domain，P）［2］。其中P区可进一步分为相对保守的P1区和高度变异的P2区，前者能够增强病毒颗粒稳定性，后者位于VP1最外层，具有高度变异性，含有抗原决定簇和潜在的中和抗原表位，存在与人类组织血型抗原（histoblooding group antigens，HBGAs）的结合位点，是构成免疫原性的关键区域［3-5］。抗原表位决定了病毒的抗原特异性，能够刺激人体产生抗体或淋巴细胞，对新型表位疫苗设计具有重要意义［6-7］。目前由于NoV的基因多样性及高度变异性，且缺乏成熟的体外培养体系，严重阻碍了NoV疫苗发展［8］。因此，了解NoV的抗原表位及免疫原性对NoV疫苗发展有重要意义。

本研究利用课题组前期制备的全人源抗NoV中和性单链可变片段抗体（single-chain variable fragment antibody，scFv）［9］，应用噬菌体12肽库技术淘选获得NoV抗原模拟表位，并对抗原模拟表位进行初步鉴定，为后续NoV治疗性单链抗体药物和广谱保护性疫苗研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒购自美国NEB公司；M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；HRP-羊抗鼠IgG购自美国Abcam公司；TMB辣根过氧化物酶底物显色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；源于GⅡ.6 NoV及GⅡ.17暴发感染者恢复期PBMC制备的NoV人源中和性scFv、GⅡ.4/GⅡ.6/GⅡ.17 NoV P蛋白、抗GⅡ.4/GⅡ.6/GⅡ.17小鼠血清及B型唾液由南方医科大学流行病学实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体展示随机十二肽库淘选 选取课题组前期制备的源于GⅡ.6及GⅡ.17 NoV患者恢复期外周血的NoV人源中和性scFv［9］各6株，抗体来源见表1。噬菌体展示文库筛选参照试剂盒说明书（E8110S）操作，以scFv与噬菌体展示文库分别作用，进行三轮“吸附-洗涤-洗脱”生物淘选即可获得与ScFv特异性结合的噬菌体。

表1 用于生物淘选NoV抗原模拟表位的scFv来源Tab.1 Source of scFv antibodies for biopanning of NoV antigen mimic epitopes

1.2.2 ELISA初步鉴定单克隆噬菌体 随机挑取第3轮洗脱后的多个单克隆噬菌体进行扩增纯化，鉴定噬菌体与scFv亲和活性以及与NoV P蛋白的竞争作用。

1.2.2.1 Phage-ELISA鉴定噬菌体亲和性 将scFv（2 μg/ml）包被于酶标板，4 ℃过夜后用5%脱脂奶粉封闭，以纯化的噬菌体为一抗，阴性对照为淘选过程中洗涤下来未与scFv结合的噬菌体。加入anti-M13-HRP抗体（1∶3 000）作为二抗，TMB避光显色，2 mol/L磷酸终止反应，读取各孔OD450。若实验孔OD450＞阴性孔OD4502倍，则判定为阳性噬菌体。实验孔均设两孔平行重复。

1.2.2.2 阳性噬菌体与P蛋白竞争作用鉴定 将scFv（2 μg/ml）包被于酶标板，4 ℃过夜后用5%脱脂奶粉封闭，加入阳性噬菌体50 μl和NoV P蛋白50 μl（GⅡ.6 P蛋白4 μg/ml，GⅡ.17 P蛋白0.4 μg/ml）混合液作为一抗，以anti-M13-HRP抗体（1∶3 500）为二抗，TMB避光显色，2 mol/L磷酸终止反应，读取各孔OD450。抑制率（%）=（阳性对照OD450-实验组OD450）/阳性对照OD450×100%。实验孔均设置两孔重复。

1.2.3 阳性噬菌体DNA提取分析 参照M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒说明书，提取阳性噬菌体DNA，送华大基因公司测序，以Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒的-96gⅢ为测序引物。获得的12肽序列用DNASTAR MegAlign程序与NoV VP1的氨基酸序同源性对比分析，选取出现次数较多且同源性高的多肽序列进行后续分析。

1.2.4 生物信息学分析 利用DNAstar软件protean程序分析多肽抗原模拟表位在VP1中所在区域的β转角、无规卷曲等二级结构情况，并分析其抗原性指数、亲水性指数及表面可及性指数。使用蛋白结构预测SwissModell server（https：//swissmodel.expasy.org/）在线软件，对GⅡ.4/GⅡ.6/GⅡ.17 NoV VP1进行同源建模获得其三维结构，PyMol软件分析抗原模拟表位在VP1中的定位。

1.2.5 ELISA检测多肽与GⅡ.6 NoV P蛋白竞争抑制 多肽MGLDLWENFQVL（纯度98%）由广州睿博生物技术有限公司合成，分别包被与GⅡ.6 NoV P蛋白结合最优的唾液类型（B型；1∶1 000），4 ℃过夜后用5%脱脂奶粉封闭，加入梯度稀释的多肽和GⅡ.6 NoV P蛋白混合液37 ℃孵育1 h。以鼠抗GⅡ.6血清（1∶3 500）为一抗，HRP-羊抗鼠IgG（1∶5 000）为二抗，TMB避光显色后测定OD450。实验孔均设置复孔，以无关多肽为阴性对照，计算多肽抑制率，公式同1.2.2.2。

2 结果

2.1 噬菌体随机12肽库淘选 经过3轮“吸附-洗涤-洗脱”生物淘选，产出率逐轮升高，说明有效富集了可与scFv特异性结合的噬菌体，淘选结果见表2。

表2 噬菌体随机12肽库对源于G Ⅱ.6 NoV暴发和GⅡ.17 NoV暴发的scFv淘选结果Tab.2 Panning results of phage display peptide library against scFv derived from a GⅡ.6 NoV outbreak and a G Ⅱ.17 NoV outbreak

2.2 单克隆噬菌体初步鉴定

2.2.1 Phage-ELISA鉴定噬菌体亲和活性 包被与生物淘选过程中相应的scFv，以未与抗体结合的噬菌体为阴性对照，进行Phage-ELISA鉴定，阳性噬菌体与抗体的亲和活性结果见图1。

图1 阳性噬菌体克隆与源于G Ⅱ.6 NoV、GⅡ.17 NoV暴发的scFv的结合活性分析Fig.1 Affinity analysis of positive phage clones with scFv derived from GⅡ.6 NoV and GⅡ.17 NoV outbreak

2.2.2 竞争抑制ELISA筛选NoV抗原模拟表位对阳性噬菌体进行竞争抑制ELISA试验，发现GⅡ.6 NoV P蛋白能不同程度地抑制阳性噬菌体与scFv结合，抑制率为19.12%～89.61%（图2A）。GⅡ.17 NoV P蛋白也能抑制阳性噬菌体与scFv结合，抑制率为10.70%～83.76%（图2B）。

图2 G Ⅱ.6 NoV、GⅡ.17 NoV P蛋白对阳性噬菌体克隆与scFv抗体结合的竞争抑制作用Fig.2 Competitive inhibition of GⅡ.6 NoV and GⅡ.17 NoV P proteins on binding of positive phage clones and scFv

2.3 阳性噬菌体克隆的DNA序列分析 将对NoV P蛋白有抑制作用的阳性噬菌体进行DNA提取并送测序分析，最终得到27条不同碱基序列并将其翻译为氨基酸序列（表3、表4）。其中MGLDLWENFQVL和FHWPSYYLTPWV出现频次较多，分别为47次和3次，提示其展示了scFv与NoV结合的高亲和力高肽段。同源性对比这两条肽段与NoV VP1蛋白有3段有高同源性的氨基酸序列（图3、图4）：MGXDXWWXXPXY和YXXXXXXXLXPXXWV（其中X代表任一氨基酸）。

图3 G Ⅱ.6 NoV VP1区域与多肽MGLDLWENFQVL的高同源性片段Fig.3 High homology fragment between G Ⅱ.6 NoV VP1 region and MGLDLWENFQVL

图4 GⅡ.4/GⅡ.6/G Ⅱ.17 NoV VP1区域与多肽FHWPSYYLTPWV的高同源性片段Fig.4 High homology fragment between GⅡ.4/GⅡ.6/G Ⅱ.17 NoV VP1 region and FHWPSYYLTPWV

图5 GⅡ.4/GⅡ.6/G Ⅱ.17 NoV VP1中部分区域二级结构分析Fig.5 Secondary structure analysis of some regions in GⅡ.4/GⅡ.6/G Ⅱ.17 NoV VP1

图6 “MG-D-W”“W-P-Y”“Y-L-P-WV”在G Ⅱ.6 NoV VP1三维结构的位置Fig.6 Location of "MG-D-W""W-P-Y""Y-L-P-WV" in 3D structure of G Ⅱ.6 VP1

表3 源于G Ⅱ.6 NoV暴发的scFv的阳性噬菌体克隆氨基酸序列Tab.3 Amino acid sequences of positive phage clones for scFv derived from G Ⅱ.6 NoV outbreak

表4 源于GⅡ.17 NoV暴发的scFv的阳性噬菌体克隆氨基酸序列Tab.4 Amino acid sequences of positive phage clones for scFv derived from GⅡ.17 NoV outbreak

2.4 生物学信息分析

2.4.1 多肽抗原模拟表位与VP1二级结构的关系 蛋白潜在的抗原表位具有亲水性、柔韧性、抗原指数和表面可及性较高的特征且常位于转角或无规则卷曲区域，其中抗原指数、亲水性＞0及表面可及性＞1形成表位的可能性较大［10］。Protean分析发现，序列“MG-D-W”位于GⅡ.6 VP1蛋白402～407氨基酸区域，该区域中具有丰富的无规则卷曲结构且亲水性＞0、抗原性＞0及表面可及性＞1，该序列为GⅡ.6抗原表位的可能性较大。而在GⅡ.4/GⅡ.6/GⅡ.17这三株NoV的VP1蛋白中序列“W-P-Y”和序列“Y-L-P-WV”所在区域分别有抗原性＜0、表面可及性＜1，抗原性＜0等情况（Protean分析结果通过VP1整条序列获得的，图4仅截取部分结果）。

2.4.2 多肽抗原模拟表位与VP1三维结构的关系 “MG-D-W”处于无规则卷曲结构，与Protean分析结果一致，这4个氨基酸间距离较近，并暴露于GⅡ.6 VP1蛋白P2区表面，而P2区是存在NoV与HBGA受体结合位点和主要抗原位点的主要区域［3］。此外，“MG-D-W”高度暴露且具有良好的嵌合结构，易被宿主免疫系统作为产生中和抗体的目标。“W-P-Y”和“Y-L-P-WV”分别位于VP1蛋白P2区域和P1区域，分别有色氨酸、酪氨酸暴露于VP1蛋白表面，其余氨基酸深埋于VP1蛋白，不利于抗体结合（绿色区域为VP1蛋白P1区，灰色为P2区，蓝色为S区，“MG-D-W”“W-P-Y”及“Y-L-P-WV”分别以红色、紫色、橙色显示；“MG-D-W”仅出现于GⅡ.6VP1，而“W-P-Y”“Y-L-P-WV”在GⅡ.4和GⅡ.17 VP1三维结构的位置及二级结构均与GⅡ.6相同，因此仅展示GⅡ.6）。综上，“MG-D-W”为抗原表位的可能性较大，且可能为GⅡ.6的特异性抗原表位。

2.5 多肽与P蛋白的竞争抑制ELISA 在合成多肽MGLDLWENFQVL与GⅡ.6 NoV P蛋白的竞争抑制ELISA实验中，随着多肽浓度逐渐升高，对P蛋白和HBGA的结合抑制作用逐渐增强（图7）。

图7 梯度稀释多肽对GⅡ.6 NoV P蛋白与HBGA受体结合的竞争抑制作用Fig.7 Competitive inhibition of GⅡ.6 NoV P protein binding to HBGA receptors by gradient dilution peptides

3 讨论

抗原表位又称抗原决定簇，对其进行分析鉴定能够为疫苗和抗病毒药物研发提供重要信息［11］。传统的抗原表位分析方法是通过人工合成一系列抗原蛋白肽段，再用ELISA、Western blot等方法鉴定这些肽段与相应抗体的结合能力，以此获得抗原表位氨基酸序列、位置信息等。这种方法工作量大、费用高，且人工合成的蛋白肽段仅能模拟线性表位［12-13］。或用X射线衍射技术进行抗原表位研究，通过晶体学信息准确分析抗原表位的氨基酸构成及表位类型，该方法操作过程复杂，费用高，且仅在已知合适晶体情况下才能应用［14］。噬菌体展示技术是目前抗原表位筛选主流方法之一，是基于外源多肽或蛋白与噬菌体衣壳蛋白融合的一种技术，包被目的抗体后利用噬菌体随机12肽库进行生物淘选，即可获得与目的抗体特异性结合的抗原表位［15-17］。噬菌体展示技术具有高亲和选择、高分辨率等优点，能够识别抗NoV多克隆抗体及scFv中的多个不同抗原表位，有助于了解NoV表位分布［18］。具有中和作用的抗体是筛选和鉴定NoV抗原表位的重要工具，与传统单克隆抗体相比，本研究所用的scFv体积较小，具有较高分辨率，能够发现单克隆抗体未能识别的抗原表位［19］。

本研究利用Ph.D.-12噬菌体展示肽库，以与GⅡ.4/GⅡ.6/GⅡ.17 NoV P蛋白具有高特异性且中和能力较强的scFv作为靶标蛋白进行生物淘选，获得了与scFv特异性结合的噬菌体。以ELISA鉴定噬菌体，并对阳性噬菌体进行测序获得其递呈的十二肽序列，有2条出现频次较多的序列MGLDLWENFQVL和FHWPSYYLTPWV。生物信息学分析结果提示“MG-D-W”为GⅡ.6抗原表位的可能性较大，可能模拟了GⅡ.6 NoV与scFv结合的抗原表位。通过合成多肽进一步验证以排除噬菌体自身的影响，发现随着多肽浓度升高其阻断P蛋白与HBGA受体结合的能力增强。

GⅡ.6 NoV以散发为主，较少引起暴发流行［20］。2016-2018年，我国疫情监测数据显示：GⅡ.6引起的NoV暴发共有16起（3.4%）［21］。同时，GⅡ.6在美国、巴西、阿根廷、日本等国引起了多起NoV胃肠炎暴发［22-25］，成为幼儿感染NoV的第二大常见毒株，提示GⅡ.6发病率在全球范围内呈现一定上升趋势。因此，有学者根据河北省正定县50多年的腹泻监测数据分析结果，提出GⅡ.6应纳入NoV疫苗候选毒株［26］。但目前NoV候选疫苗主要集中于GⅠ.1、GⅠ.3、GⅡ.3、GⅡ.4和GⅡ.17 NoVs几种基因型，尚无GⅡ.6疫苗研发，且关于GⅡ.6 NoV抗原表位的研究较少，QIU等［27］首次提出GⅡ.6 NoV与HBGA的结合区域位于286～312氨基酸残基之间。因此本研究成功筛选并鉴定的GⅡ.6 NoV的抗原表位“MG-D-W”，能够为NoV疫苗设计提供重要信息。