基于生物信息学研究宫内生长受限的免疫机制及中药预测

杜志欣 刘岳轩 张一格 江煜 张桐 杨丽萍

（1.河南中医药大学医学院，郑州 450046；2.河南中医药大学第二临床医学院，郑州 450046）

宫内生长受限（intrauterine growth restriction，IUGR）是围产儿死亡的第二大原因，与多种不良妊娠结局相关，同时影响患者儿童期以及成年期的健康，与成年后的神经系统疾病、心血管疾病、内分泌疾病等慢性非传染性疾病密切相关［1］。我国2019年《胎儿生长受限专家共识》将IUGR定义为受母体、胎儿、胎盘等多种因素影响，胎儿生长未达到其应有的生长潜能，多表现为超声估测胎儿体质量或腹围低于相应胎龄第10百分位数以下的胎儿［2］。随着我国二孩政策的开放，IUGR的发病率日益升高，影响我国的经济发展与家庭幸福感。目前国内外对IUGR发病机制已有一定研究，包括胎儿、母体及胎盘等，但具体机制仍未明确。

现有研究发现母胎的免疫耐受在妊娠过程中发挥重要作用［3］。胎儿和母体的免疫细胞如淋巴细胞、调节性T细胞、巨噬细胞等之间的作用是妊娠所必需的［4］。母胎界面的免疫失调是IUGR、先兆子痫等妊娠疾病发生的主要原因［5］。从免疫的角度研究IUGR的发生发展已经成为学者研究的热点。

本文通过生物信息学对IUGR胎盘的芯片数据进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）分析，通过R包筛选IUGR胎盘组织与正常胎盘组织之间的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），对DEGs进行富集分析并寻找出影响IUGR发病的关键基因，通过关键基因的受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析评价关键基因的诊断效能。通过单样本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）算法评估24种免疫细胞在IUGR胎盘的相对含量分析，进行关键基因与免疫浸润的相关性分析，筛选免疫相关的关键基因并对其进行中药预测。本研究旨在为IUGR的诊断与治疗提供思路和方法，为研究IUGR发生发展的分子机制和实验研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 芯片数据来源 以“fetal growth restriction”为关键词，基于GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）检索基因表达谱，选择“Homo sapiens”人类样本，获得编号为GSE12216的数据集。该数据集共包含16个样本，8个健康对照组及8个IUGR组的胎盘样本，平台为GPL2986、ABI Human Genome Survey Microarray Version 2。

1.2 芯片数据预处理和DEGs的筛选 对芯片数据进行处理后，通过“ggplot2”包对质量控制后的芯片数据进行可视化分析。R语言“limma conductor”软件包对芯片数据进行分析，以|log2FC|＞1，P＜0.05作为筛选标准［6］。基于“ggplot2”包，根据差异表达数据绘制火山图，同时使用“ComplexHeatmap”包绘制基因矩阵热图。

1.3 GSEA分析 GSEA分析对数据集所有基因进行分析，可以敏感地找到显著富集的基因集及其变化趋势。运用R“clusterProfiler”包进行GSEA的基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析［7］，并使用“ggplot2”对富集前5结果进行可视化，以FDR＜0.25且P＜0.05为筛选标准。

1.4 DEGs功能富集分析及关键基因的筛选 运用R包“GOplot”对DEGs进行结合log值的GO与KEGG分析［8］。将DEGs输入STRING（https：//stringdb.org/）数据库进行蛋白-蛋白相互作用（proteinprotein interaction，PPI）分析，选取得分＞0.9的基因通过Cytoscape软件进行可视化分析。应用Cytoscape中的CytoHubba插件的最大集团中心度（maximal clique centrality，MCC）算法找出排名前10的基因定义为关键基因［9］。

1.5 关键基因的ROC分析 对关键基因进行ROC分析，采用R语言的“pROC”包进行数据分析，“ggplot2”包用于可视化分析，相关基因的治疗与诊断作用根据血药浓度-时间曲线下面积（area under curve，AUC）进行评价［10］。

1.6 免疫浸润分析 ImmuCellAI（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/ImmuCellAI/#！/）是科研团队基于ssGSEA算法开发的一种T细胞浸润丰度分析的工具，可以计算24种免疫细胞丰度［11］。通过ImmuCellAI获得样本的免疫细胞浸润情况，使用“ggplot2”包创建了包含24种免疫细胞类型的热图。两组之间免疫细胞的丰度差异通过Wilcoxon秩和检验分析比较，以P＜0.05为筛选标准，使用“ggplot2”包进行可视化分析。

1.7 关键基因与免疫浸润的相关性分析及潜在中药预测 通过Spearman统计分析的方法计算关键基因与免疫细胞丰度之间的相关性，并通过“ggplot2”包可视化分析［12］。Coremine Medical（https：//coremine.com/medical/#search）用于筛选与关键基因相关的中药［13］。根据预测结果，对中药进行功效及归经的统计分析，并筛选出现频次最高的中药进行网络药理学分析。

从TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems pharmacology）数据库（口服生物利用度≥30%，类药性≥0.18）以及BATman（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）数据库筛选活性成分及相关靶点信息。通过蛋白质数据库UniProt（http：//www.uniprot.org/uploadlists/）统一靶点名称。基于CytoHubba的MCC算法筛选出排列前20的靶点。

2 结果

2.1 DEGs芯片数据质量控制 将基因芯片GSE12216数据集中的数据进行标准化处理，并绘制均一化图（图1）。结果显示，16个样本数据的中位数基本处于一条线上，表明该数据集质量可靠，可进行下一步数据分析。

2.2 DEGs的筛选 基于GEO数据库将GSE12216中8例正常胎盘样本和8例IUGR胎盘样本分为对照组和实验组进行差异基因筛选，共获得228个DEGs，其中上调基因154个，下调基因74个，热图与火山图如图2。

图2 GSE12216的热图（A）与火山图（B）Fig.2 Heat map （A） and volcano map （B） of GSE12216

2.3 GSEA基因富集分析 对数据集基因进行GSEA分析，GSEA-KEGG结果显示（图3），IUGR组胎盘基因主要富集于溶酶体信号通路、细胞周期信号通路、鞘糖脂生物合成的血红蛋白信号通路、类固醇激素生物合成信号通路以及剪接体信号通路。其中，溶酶体信号通路具有最高的标准化富集得分（normalized enrichment score，NES）（NES=1.77，P＜0.001）。GSEA-GO分析显示（图4），IUGR胎盘基因显著富集在趋化因子受体结合、对趋化因子的反应、G蛋白偶联神经递质受体活性、有丝分裂DNA复制以及趋化因子活性，其中，趋化因子受体结合（NES=-2.06，P＜0.001）。

图3 GSEA-KEGG分析Fig.3 GSEA-KEGG analysis

图4 GSEA-GO分析Fig.4 GSEA-GO analysis

2.4 DEGs功能富集分析及关键基因的筛选 对DEGs进行GO功能分析和KEGG通路分析（图5），GO分析结果显示其生物过程主要集中在氧化应激、胎盘发育以及神经元发育等方面；细胞组成主要集中在质膜、薄膜筏、膜微区、突触后膜等部位。KEGG信号通路富集分析显示TNF信号通路、IL-17信号通路和NF-κB信号通路显著富集。将差异基因导入STRING数据库中进行PPI分析，通过Cytoscape软件绘制PPI网络，通过CytoHubba的MCC算法筛选出10个关键基因：CSF2、IRAK1、PTGS2、FLT1、CHUK、CXCL12、FOS、LEP、CXCL2以及RELB（附图1，www.immmune99.com）。

图5 DEGs的GO（A）和KEGG（B）分析Fig.5 GO （A） and KEGG （B） analysis of DEGs

2.5 关键基因的ROC分析 对10个关键基因进行ROC分析（图6），结果显示10个关键基因均AUC＞0.7，提示关键基因的诊断价值良好。

图6 关键基因的ROC分析Fig.6 ROC analysis of hub genes

2.6 免疫浸润分析 基于ImmuCellAI进行免疫浸润分析。热图显示了每个样本中24种免疫细胞类型（图7）。豆荚图显示了IUGR组与正常组胎盘组织样本中免疫浸润细胞的差异（图8）。研究发现在IUGR胎盘组织中自然杀伤T（natural killer T，NKT）细胞明显增多（P＜0.001）；单核细胞在IUGR组的胎盘组织中减少（P＜0.05）。

图7 IUGR免疫浸润热图Fig.7 IUGR immune infiltration heat map

图8 IUGR与正常组胎盘的免疫浸润差异分析Fig.8 Analysis on difference of placental immune infiltration between IUGR and normal group

2.7 关键基因与免疫细胞浸润相关性分析及中药预测 相关性热图提示关键基因CSF2、IRAK1、PTGS2、CHUK、CXCL12、CXCL2以及RELB与免疫细胞浸润有较高的相关性（图9）。

图9 关键基因与免疫浸润的相关性热图Fig.9 Heat map of correlation between hub genes and immune infiltration

将7个免疫浸润相关关键基因映射到Coremine Medical数据库，筛选出潜在中药，以P＜0.05为差异有统计学意义，共筛选出143味相关中药（表1）。将这些中药进行归经以及功效分析，结果显示IUGR免疫浸润相关中苷多归属肝经、肺经、肾经以及脾经，以清热类和补虚类中药为主（图10）。

表1 免疫相关关键基因及其映射的中药Tab.1 Immune related key genes and their mapping of traditional Chinese medicine

结合文献研究结果发现免疫相关中药出现频次最高的为人参以及黄芩。故筛选上述2味中药构建“药物-活性成分-作用靶点”网络（附图2，www.immune99.com）。基于CytoHubba插件通过MCC算法筛选排列前20的靶点，结果提示，人参和黄芩的药物活性成分参与调节TNF、IL6、JUN、TP53以及AKT1等基因，可能成为治疗IUGR的潜在中药。见图11。

图11 免疫相关中药治疗IUGR关键靶点图Fig.11 Targets of immune-related traditional Chinese medicine in treatment of IUGR

3 讨论

IUGR的发病与母胎免疫系统环境的异常密切相关，寻找影响IUGR患者母胎免疫系统环境中的关键基因或功能对于在分子水平上揭示IUGR的发病机制具有重要意义，也可为IUGR的早期诊断和新治疗策略的制定提供依据。本研究通过对正常和IUGR胎盘组织进行DEGs分析，筛选出228个DEGs，包括上调基因154个和下调基因74个。根据全基因组的GSEA分析可知，IUGR组胎盘基因的GO富集主要集中在趋化因子及其受体。趋化因子与其受体的相互作用在免疫反应、细胞及器官的发育以及炎症反应等方面均发挥重要作用。研究发现趋化因子12及其受体调节子宫内膜炎症和胚胎植入的重塑，当失调时导致不良妊娠结局如IUGR和先兆子痫［14］。GSEA-KEGG富集结果显示IUGR组胎盘基因主要富集在溶酶体信号通路。溶酶体可以促进免疫反应，促进细胞的新陈代谢以及维持细胞稳态等。自噬-溶酶体系统降解蛋白质是维持胎盘发育所必需的，其功能的异常会致使胎盘发育不良，从而导致先兆子痫或IUGR等不良妊娠的发生［15］。GSEA分析结果提示，免疫功能异常与IUGR的发病密切相关。

DEGs的KEGG分析显示DEGs主要富集在TNF信号通路、NF-κB信号通路以及IL-17信号通路。TNF-α是机体免疫应答的重要组成，可以激活免疫系统［16］。TNF-α可以调节胎儿的生长发育，其表达的异常会导致胎盘的氧化应激以及血管功能障碍，从而导致IUGR的发生［17］。NF-κB是经典的炎症因子，是免疫应答的中心调节分子［18］。NF-κB途径可以诱导分离蜕膜基质细胞的凋亡与炎症，诱导不良妊娠如IUGR的发生［19］。IL-17是免疫反应的重要成员，可以调控机体免疫系统［20］。在妊娠合并IUGR以及先兆子痫中，IL-17水平升高［21］。综上所述，已有大量研究表明TNF信号通路、NF-κB信号通路以及IL-17信号通路与IUGR的发生发展有着密切联系，表明本研究对于IUGR的生物信息学分析结果可靠。DEGs的功能富集结果进一步提示，IUGR的发生发展与机体免疫功能关系密切。

通过Cytohubba软件的MCC算法，研究预测了与IUGR发病具有紧密关联的10个关键基因：

CSF2、IRAK1、PTGS2、FLT1、CHUK、CXCL12、FOS、LEP、CXCL2以及RELB，重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子2（colony stimulating factor 2，CSF2）可以介导母胎界面的免疫调节，参与胚胎生长发育［22］。白细胞介素1受体相关激酶1（interleukin 1 receptor associated kinase 1，IRAK1）在流产患者中表达增加［23］。前列腺素内过氧化物合成酶2（prostaglandinendoperoxide synthase 2，PTGS2）与卵泡的生长发育密切相关，其表达的增加可以改善不良妊娠结局［24］。血管生长因子受体1（vascular endothelial growth factor receptor-1，FLT1）是胎盘功能障碍的生物标志物，可用于识别IUGR等不良妊娠的发生［25］。螺旋环螺旋结构域扩散激酶（conserved helix-loophelix ubiquitous kinase，CHUK）可影响NF-κB信号通路活性，从而参与IUGR病理过程［26］。趋化因子配体12（CXC chemokine ligand 12， CXCL12）是胎盘血管生成的关键驱动因素，在IUGR患者中表达水平升高［27］。原癌基因（FBJ osteosarcoma oncogene，FOS）可以影响胎盘滋养层细胞的增殖，在IUGR患者表达降低［28］，瘦素可以调节胎盘的细胞增殖、蛋白质合成、侵袭和凋亡等过程，其表达的改变与流产、先兆子痫以及IUGR的发病息息相关［29］。转录因子RELB可以调节胎盘中促肾上腺皮质激素释放和前列腺素的释放，在妊娠中发挥重要作用［30］。趋化因子配体2（CXC chemokine ligand 2， CXCL2）在早产小鼠的胎盘中表达上升［31］。对10个关键基因进行ROC分析发现10个关键基因均有良好的诊断效果，进一步验证了关键基因的准确性。

为深入探索免疫浸润在IUGR发病中的作用，本研究利用ssGSEA算法对样本进行分析。结果显示，与正常的胎盘组织相比，IUGR胎盘组织中NKT细胞明显增多，单核细胞在IUGR胎盘组织中减少。NKT细胞介导了胎儿母体免疫，在妊娠早期的Th1型应答中起重要作用，NKT细胞的激活会导致小鼠流产［32］。单核细胞能够吞噬衰老、受伤的细胞和入侵人体内部的异物，对人体免疫功能发挥重要作用。研究表明，淋巴细胞与单核细胞比例的增高提示不良妊娠的发生［33］。以上文献研究提示本预测具有一定的参考意义。此外，本研究通过评估IUGR胎盘相关免疫细胞的浸润情况及分析关键基因表达水平的高低与不同免疫细胞浸润程度的相关性，发现这7个关键基因的异常表达与免疫细胞的浸润有一定相关性。

为了从众多中药中筛选治疗IUGR的药物，本文通过COREMINE数据库对干预IUGR免疫浸润的相关中药进行预测并对其归经和功效分析，发现药物多归于肺经、肝经以及肾经且药物多为清热类以及补虚类。根据预测结果选出出现频数最高的中药，并结合相关文献研究，发现人参以及黄芩最有可能通过干预IUGR的免疫机制起到治疗效果。人参味甘微温，自古以来便有百草之王之称。现代研究发现人参发挥重要的免疫调节作用，可以增强机体的免疫功能［34］。临床研究发现人参治疗先兆流产的疗效可靠，这与人参能提高机体免疫力以及抑制血清TNF-α的分泌等机制有关［35］。实验研究发现人参茎叶总皂苷可以通过抑制炎症反应以及氧化应激改善IUGR大鼠的妊娠结局［36］。黄芩为性寒味苦，具有清热安胎之功效，临床常用黄芩来治疗妊娠类疾病［37］。黄芩苷是黄芩的主要活性成分，具有抗炎和抗凋亡的功能，黄芩苷可有效减轻先兆子痫大鼠胎盘中的促炎细胞因子产生，抑制免疫反应，改善妊娠结局［38］。黄芩苷还可提高IUGR胎鼠存活率，增加IUGR胎鼠体质量［39］。以上文献研究进一步证实人参以及黄芩最有可能通过干预机体免疫功能，作为IUGR分子治疗药物的潜在来源。

本文利用生物信息学方法对于IUGR的免疫浸润机制进行分析，并预测免疫相关关键基因所涉及的中药，对于IUGR的机制研究及临床用药具有参考意义。本研究局限之处在于数据分析来源依赖于GEO数据库中的IUGR芯片，芯片纳入的样本数量有限，对于结果的分析可能造成偏差，因此需要进一步实验验证。