利拉鲁肽调控Nrf2/ARE介导的焦亡通路减轻2型糖尿病大鼠心肌损伤的机制研究

庄天微 帅天姣 郭长秀 谢伟 王彤彤 （.牡丹江医学院附属红旗医院内分泌科，牡丹江 57000；.牡丹江医学院附属红旗医院眼科，牡丹江 57000；.黑龙江省牡丹江林业中心医院骨科，牡丹江 570）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）的一种严重并发症，是DM患者死亡的主要原因之一，其特点为心肌结构及功能障碍，而心肌细胞死亡是DCM的基本病理特征［1］。尽管现今已有多种药物控制血糖及恢复心脏功能，但DCM的发病率和病死率仍在持续增长［2］。细胞焦亡是一种炎症相关的细胞程序性死亡，参与DCM的发生发展［3］。有效抑制细胞焦亡对DCM患者的生存至关重要，因此迫切需要寻找相应的治疗药物。核因子E2相关转录因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）被证实参与调控抗氧化损伤，可与抗氧化反应原件（antioxidant response element，ARE）进一步结合，启动血红素氧化酶1（heme oxygenase-1，HO-1）表达，Nrf2/ARE对焦亡通路具有显著的负调控作用［3-4］。利拉鲁肽作为一种抗糖尿病药物，可有效抑制胰高血糖素生成，改善胰岛素分泌［5-6］。但目前关于利拉鲁肽DM心肌焦亡方面的研究还较少，因此，本研究通过构建2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠模型，探究利拉鲁肽调控Nrf2/ARE通路对DM大鼠心肌细胞焦亡的影响，以期为利拉鲁肽在DCM中的治疗机制研究提供进一步参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 60只SPF级SD大鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0010，于通风良好的环境中适应性饲养1周［室温：（24±3） ℃，光照12 h/d］。

1.1.2 试剂及仪器 HE染色试剂盒、链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（上海联硕宝为生物科技有限公司）；Nrf2抑制剂ATRA（上海陶素生化科技有限公司）；利拉鲁肽（Novo Nordisk A/S，国药准字：J20160037，3 ml∶18 mg）；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒、BCA试剂盒（北京孚博生物科技有限公司）；兔抗β-actin、HRP-IgG抗体、Nrf2抗体、HO-1抗体（Abcam）；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）抗体（Affinity Biosciences）；凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）（AdipoGen）；IL-18试剂盒（武汉菲恩生物科技有限公司）；IL-1β试剂盒（上海广锐生物科技有限公司）；兔抗IL-1β、IL-18抗体（Proteintech）；GelSMART凝胶成像仪［大龙兴创实验仪器（北京）有限公司］。

1.2 方法

1.2.1 分组与T2DM模型构建 构建T2DM大鼠模型，采用高糖高脂饲料喂养大鼠8周后腹腔注射35 mg/kg STZ（溶于柠檬酸缓冲液），7 d后随机进行3次尾静脉取血检测，血糖水平均＞11.1 mmol/L则为造模成功［7］；将造模成功的SD大鼠（10只/组，共50只）随机分为T2DM组、低剂量组（35 μg/kg利拉鲁肽）、中剂量组（70 μg/kg利拉鲁肽）、高剂量组（140 μg/kg利拉鲁肽）、高剂量+Nrf2抑制组（140 μg/kg利拉鲁肽+Nrf2抑制剂ATRA 10 mg/kg）［8-9］；另取10只大鼠设为对照组，全程给予基础饲料，注射等剂量柠檬酸缓冲液。低剂量组、中剂量组、高剂量组、高剂量+Nrf2抑制组大鼠分别腹腔注射相应剂量药物，对照组及T2DM组注射等量生理盐水（2次/d，12周）。

1.2.2 血糖水平检测 实验结束后，全部大鼠禁食12 h，取尾部静脉血并用血糖仪纸片法检测血糖水平。

1.2.3 ELISA检测大鼠血清中IL-1β及IL-18水平

取各组大鼠腹主动脉血，3 000 r/min离心10 min，取上清，根据IL-1β及IL-18 ELISA试剂盒操作步骤测定血清中二者水平。

1.2.4 HE染色 各组随机选取5只大鼠，取其心脏组织进行常规石蜡包埋并连续切片（4 μm），部分使用HE染色试剂盒染色后封片，显微镜观察；另一部分进行TUNEL染色。

1.2.5 TUNEL染色 取石蜡切片，经烘干、PBS清洗后，置于TUNEL反应液中孵育1 h后滴加DAB显色，苏木精复染，脱水，封片，光镜观察并拍照（棕褐色即为阳性染色细胞），Image ProPlus 6.0系统细胞计数后计算凋亡指数（apoptotic index，AI）（%）=（凋亡细胞/总细胞）×100%。

1.2.6 Western blot检测心肌中焦亡相关蛋白表达 取各组剩余的5只大鼠，心脏组织于裂解液中研磨，12 000 r/min离心10 min，取上清后BCA法测定蛋白含量，取蛋白样品并混入上样缓冲液（4∶1），变性（100 ℃），加至已配制好的分离胶中（30 μg/孔）进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%牛血清白蛋白封闭1 h，加入一抗（兔抗β-actin、Caspase-1、ASC、Nrf2、HO-1、IL-1β、IL-18抗体，1∶1 000）孵育过夜后，于次日依次进行TBST洗涤及二抗孵育（2 h），ECL显影后，于蛋白凝胶成像仪中观察，Image J分析各条带灰度值，并计算其含量（β-actin为内参，n=5）。

1.3 统计学方法 采用SPSS24.0分析处理计量资料，并用±s描述，多组间比较行One-Way ANOVA分析，组间比较行SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖水平比较 相较于对照组，T2DM组大鼠空腹血糖水平显著升高（P＜0.05）；相较于T2DM组，低剂量组空腹血糖水平差异无统计学意义（P＞0.05），中、高剂量组空腹血糖水平依次显著降低（P＜0.05）；相较于高剂量组，高剂量+Nrf2抑制组空腹血糖水平显著提高（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠血糖及炎症因子水平比较（±s，n=10）Tab.1 Comparison of blood glucose and inflammatory factors levels of rats in each group （±s，n=10）

表1 各组大鼠血糖及炎症因子水平比较（±s，n=10）Tab.1 Comparison of blood glucose and inflammatory factors levels of rats in each group （±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with T2DM group，2）P＜0.05；compared with low dose group，3）P＜0.05；compared with medium dose group，4）P＜0.05；compared with high dose group，5）P＜0.05.

Groups Control T2DM Low dose Medium dose High dose High dose+Nrf2 inhibition Fasting blood glucose/（mmol·L-1）5.70±1.01 26.84±3.051）25.05±3.84 16.84±2.182）3）8.50±1.032）3）4）IL-18/（pg·ml-1）20.14±2.11 69.01±5.391）65.95±6.80 48.69±4.082）3）31.46±4.362）3）4）IL-1β/（pg·ml-1）18.05±2.54 53.61±4.931）50.04±5.76 45.18±4.332）3）29.10±3.222）3）4）15.05±2.955）46.92±5.225）43.81±4.165）

2.2 各组大鼠炎症因子水平比较 相较于对照组，T2DM组大鼠血清IL-18及IL-1β水平显著升高（P＜0.05）；相较于T2DM组，中、高剂量组IL-18及IL-1β水平依次显著降低（P＜0.05）；相较于高剂量组，高剂量+Nrf2抑制组IL-18及IL-1β水平显著升高（P＜0.05），见表1。

2.3 大鼠心肌组织病理学情况观察 对照组大鼠心肌细胞结构清晰、完整，排列有序，未发生炎症细胞浸润现象；相较于对照组，T2DM组心肌细胞肥大、排列紊乱、肌纤维结构模糊不清，发生炎症细胞浸润现象；相较于T2DM组，低剂量、中剂量组、高剂量组心肌肥大及炎症细胞浸润现象减轻，心肌细胞结构较为完整，排列逐渐有序；相较于高剂量组，高剂量+Nrf2抑制组上述心肌损伤现象加重。见图1。

图1 心肌组织病理学情况观察（HE，×200）Fig.1 Observation of myocardial histopathology （HE，×200）

2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡水平比较 相较于对照组，T2DM组大鼠心肌细胞凋亡水平显著升高（P＜0.05）；相较于T2DM组，中、高剂量组细胞凋亡水平依次显著降低（P＜0.05）；相较于高剂量组，高剂量+Nrf2抑制组细胞凋亡水平显著升高（P＜0.05），见表2、图2。

图2 各组大鼠心肌细胞凋亡水平比较（×400）Fig.2 Comparison of apoptosis levels of rat cardiomyocytes in each group （×400）

表2 各组大鼠心肌细胞凋亡水平比较（±s，n=5）Tab.2 Comparison of apoptosis levels of rat cardiomyocytes in each group （±s，n=5）

表2 各组大鼠心肌细胞凋亡水平比较（±s，n=5）Tab.2 Comparison of apoptosis levels of rat cardiomyocytes in each group （±s，n=5）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with T2DM group，2）P＜0.05；compared with low dose group，3）P＜0.05；compared with medium dose group，4）P＜0.05；compared with high dose group，5）P＜0.05.

AI/%3.07±0.27 37.20±10.391）34.80±7.21 22.47±4.092）3）10.03±2.232）3）4）23.27±3.665）Groups Control T2DM Low dose Medium dose High dose High dose+Nrf2 inhibition

2.5 各组大鼠心肌焦亡相关蛋白表达比较 相较于对照组，T2DM组大鼠心肌组织中焦亡相关蛋白Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18表达水平升高，Nrf2、HO-1表达水平降低（P＜0.05）；相较于T2DM组，中、高剂量组Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18表达水平降低，Nrf2、HO-1表达水平升高（P＜0.05）；相较于高剂量组，高剂量+Nrf2抑制组Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18表达水平均升高，Nrf2、HO-1表达水平降低（P＜0.05），见表3、图3。

图3 各组大鼠心肌焦亡相关蛋白表达比较Fig.3 Comparison of expressions of myocardial pyroptosis-associated proteins of rats in each group

表3 各组大鼠心肌焦亡相关蛋白表达比较（±s，n=5）Tab.3 Comparison of expressions of myocardial pyroptosis-associated proteins of rats in each group （±s，n=5）

表3 各组大鼠心肌焦亡相关蛋白表达比较（±s，n=5）Tab.3 Comparison of expressions of myocardial pyroptosis-associated proteins of rats in each group （±s，n=5）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with T2DM group，2）P＜0.05；compared with low dose group，3）P＜0.05；compared with medium dose group，4）P＜0.05；compared with high dose group，5）P＜0.05.

Groups Control T2DM Low dose Medium dose High dose High dose+Nrf2 inhibition Nrf2/β-actin 1.08±0.07 0.17±0.031）0.16±0.03 0.42±0.092）3）0.86±0.062）3）4）0.38±0.085）HO-1/β-actin 1.51±0.14 0.24±0.081）0.22±0.07 0.58±0.092）3）1.21±0.122）3）4）0.59±0.115）ASC/β-actin 0.51±0.08 1.34±0.211）1.30±0.20 0.86±0.132）3）0.64±0.072）3）4）0.85±0.105）Caspase-1/β-actin IL-1β/β-actin IL-18/β-actin 0.71±0.06 1.83±0.251）1.80±0.23 1.26±0.132）3）0.81±0.142）3）4）1.28±0.165）0.62±0.10 1.43±0.201）1.40±0.23 0.99±0.142）3）0.73±0.082）3）4）1.01±0.135）0.30±0.05 1.52±0.231）1.49±0.20 1.10±0.112）3）0.60±0.082）3）4）1.12±0.155）

3 讨论

DM是一种以高血糖为主要特征的代谢性疾病，DM患者患心血管疾病的风险较正常人高2～4倍，DCM是DM的常见并发症，也是造成DM患者死亡的主要原因［10］。心肌细胞丢失导致的心功能受损是DCM的基本病理特征。细胞焦亡是有别于细胞凋亡、坏死的促炎程序性细胞死亡，越来越多的研究表明，心肌细胞焦亡会造成DCM的发生，因此，有效抑制心肌细胞焦亡对DCM的治疗极其重要［11］。

利拉鲁肽是胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物，其降血糖功效已得到证实，而近几年，大量临床试验发现，其可降低不良心脏事件的发生风险［12-13］。利拉鲁肽可改善T2DM患者的血糖水平，并减轻患者体重，可用于代谢相关疾病手术后复发或持续的T2DM患者辅助治疗［14］。利拉鲁肽可控制糖尿病小鼠血糖水平，能够通过增加TGF-β1、PPARγ表达抑制心肌细胞凋亡，改善心肌损伤［15］。利拉鲁肽能够通过调控焦亡参与改善高糖高脂，降低胰岛功能损伤程度［16］。本研究发现，利拉鲁肽能够有效降低T2DM大鼠空腹血糖、心肌组织病理学程度、心肌细胞凋亡水平，与既往研究结果相似，该结果表明，利拉鲁肽具有降血糖，改善T2DM大鼠心肌损伤作用，提示利拉鲁肽有作为DCM潜在治疗药物的潜能［15］。

细胞焦亡是由炎症小体诱导的一种细胞死亡机制，可受多种调控因子影响，衔接蛋白ASC作为焦亡反应主要复合物，是NLRP3炎症体的主要组成，ASC的CARD和Caspase-1的CARD结合可形成NLRP3炎性体并激活Caspase-1，Caspase-1可促进IL-1β成熟并活化，诱导IL-18等炎症因子合成，扩大炎症反应，从而引发细胞焦亡［11，17］。大量研究发现，caspase-1活化促进DCM大鼠心肌细胞焦亡，IL-18、IL-1β、Caspase-1、ASC表达水平是评估焦亡水平的重要标志［18］。近来有研究指出，Nrf2/ARE广泛参与调控焦亡通路，抑制细胞焦亡的同时改善组织发育［19］。有研究发现，利拉鲁肽能够通过促进Nrf2/ARE通路蛋白表达，减少氧化产物生成，保护DM引发的脑缺血损伤［20］。本研究发现，中、高剂量利拉鲁肽处理均可显著降低T2DM大鼠IL-18、IL-1β、Caspase-1、ASC表达，上调Nrf2、HO-1表达水平，低剂量利拉鲁肽无显著变化，推测达到一定剂量的利拉鲁肽很可能通过调控Nrf2/ARE介导的焦亡通路发挥作用。为进一步证实该推论，本研究在利拉鲁肽处理的同时抑制Nrf2表达，发现抑制Nrf2能够显著增加大鼠IL-18、IL-1β、Caspase-1、ASC表达，降低Nrf2、HO-1表达水平，促进细胞焦亡，逆转利拉鲁肽对T2DM大鼠心肌损伤的改善作用，证实利拉鲁肽通过调控Nrf2/ARE介导的焦亡通路，减轻T2DM大鼠心肌细胞焦亡，改善心肌损伤。

综上所示，利拉鲁肽通过调控Nrf2/ARE介导的焦亡通路，促进Nrf2/ARE通路蛋白表达，抑制细胞焦亡，改善心肌损伤，利拉鲁肽可能成为DCM的有效治疗药物。本研究不仅对DCM的治疗机制研究具有重要价值，还为DCM新型治疗药物的寻找提供参考，是否有其他通路间接参与调控还需深入探讨，后续课题组将对此进行专项研究。