HBx蛋白抑制乙型肝炎病毒诱导肝细胞表达Ⅰ型干扰素的研究

潘颖 杨凯 陈谨 孙蓓蓓 田平平 张发苏 （.安徽医学高等专科学校医学技术学院，合肥 3060；.安徽医科大学第二附属医院检验科，合肥 3060）

Ⅰ型干扰素主要包括IFN-α和IFN-β，在病毒感染期间，宿主对病毒入侵的初始反应是诱导Ⅰ型干扰素产生并与其受体（interferon-α/β receptor，IFNAR）结合，激活酪氨酸蛋白激酶和信号转录与转录激活因子（Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）信号通路，合成多种抗病毒蛋白，如：核糖核酸依赖性蛋白激酶（protein kinase RNA dependent，PKR）、2'-5'寡聚腺苷酸合成酶（2'-5'oligoadenylate synthetase，OAS）、黏病毒抗性蛋白A（myxovirus resistance protein A，MxA），直接抑制病毒复制［1-2］。除了直接的抗病毒作用外，IFN-α还可以强烈调节宿主的先天性和适应性免疫反应［3-4］，如：增强NK细胞的增殖、CD8+T细胞和巨噬细胞的细胞毒性以及IFN-γ分泌等，以增强宿主对病原体的清除能力，因此，Ⅰ型干扰素信号通路激活是宿主早期重要的自然防御机制，在抑制病毒入侵方面发挥重要作用。然而，WIELAND等［5］对实验室感染HBV的黑猩猩进行体内研究表明，HBV不能诱导干扰素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISG）的表达，所以可以在肝脏中持续复制；SUSLOV等［6］通肝脏活检发现，HBV感染患者肝组织中IFN和ISG的表达被抑制，使得病毒不能被有效清除；本课题组亦在前期研究中发现，由HBV编码的HBx蛋白可以抑制外源性Ⅰ型干扰素诱导抗病毒蛋白MxA的合成［7］。据此，本课题组推测HBV很有可能通过损伤Ⅰ型干扰素信号通路，影响机体的先天免疫应答，从而引起病毒感染的慢性化。为此，本课题组拟研究HBV对肝细胞中Ⅰ型干扰素表达的影响，并进一步探讨可能存在的机制，为揭示HBV慢性感染与宿主免疫功能紊乱的关系提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌HepG2和HepG2.2.15细胞由安徽医学高等专科学校生化实验室保存；细胞培养基DMEM和胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine 3000TM转染试剂盒、ECL超敏发光试剂盒购自美国Thermo公司；TRIzol购自美国Life technogies公司；氯仿、异丙醇及乙醇均为分析纯；反转录试剂盒购自大连TaKaRa公司；荧光染料购自中国Novoprotein公司；BCA试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒均购自碧云天试剂公司；mock-siRNA、HBxsiRNA及引物由上海生工生物合成；HBx、p-IRF3及GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司；pEGFP-N1和pEGFP-HBx质粒由南京大学附属鼓楼医院刘巧玉博士惠赠；荧光显微镜购自德国Leica公司；荧光定量PCR仪购自美国Thermo Scientific公司；电泳仪、电泳槽购自上海天能科技有限公司；自动曝光仪购自培清科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 HepG2和HepG2.2.15细胞用含10%胎牛血清的DMEM于37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养，取对数生长期的细胞以2×105个/ml密度接种于6孔板用于转染，待细胞融合度达到80%～90%时候，改用无胎牛血清DMEM培养，以Lipofectamine 3000TM转染试剂将mock-siRNA和HBxsiRNA转染至HepG2.2.15细胞，48 h后收集细胞沉淀检测HBx蛋白表达水平；将带绿色荧光蛋白的pEGFP-N1和pEGFP-HBx质粒转染至HepG2细胞，在荧光显微镜下观察HBx蛋白的表达。

1.2.2 荧光定量PCR检测Ⅰ型干扰素IFN-α和IFN-β mRNA含量 收集转染前后的细胞沉淀，加入1 ml TRIzol完全裂解，再加入0.2 ml氯仿振荡离心取上清，加入0.5 ml预冷的异丙醇，-20 ℃孵育30 min后离心去上清，最后加入1 ml预冷的75%乙醇，12 000 r/min离心去上清，室温干燥RNA沉淀，按照TaKaRa反转录试剂盒说明书反转录为cDNA。以cDNA为荧光定量的模板，运用SYBR Green PCR试剂盒进行扩增反应，PCR仪设置扩增程序为：95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，40个循环，72 ℃20 s。目的mRNA相对表达量的计算方法为2-ΔΔCt。所用引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 Western blot检测HBx及p-IRF3蛋白含量使用RIPA细胞裂解液细胞，并以12 000 r/min离心10 min收集上清液，即含有细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。在收集的蛋白样品中按照1∶4加入蛋白上样缓冲液，经沸水浴加热10 min以充分变性蛋白质，待样品冷却至室温后，上样至加样孔内行SDSPAGE蛋白电泳1.5 h、转膜、封闭，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h。采用ECL超敏发光试剂检测目的蛋白。

1.3 统计学分析 采用MedCalc10.4软件进行数据统计分析，两组数据比较采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV对肝细胞中Ⅰ型干扰素表达的影响 荧光定量PCR分析显示，与HepG2细胞相比，转染HBV全基因组的HepG2.2.15细胞中IFN-α和IFN-β的mRNA水平升高，但差异不具有统计学意义（P＞0.05，图1），提示HBV在体外细胞中并未充分诱导Ⅰ型干扰素的表达。

图1 Ⅰ型干扰素在HepG2和HepG2.2.15细胞中的表达Fig.1 Expression of typeⅠinterferon in HepG2 and HepG2.2.15 cells

2.2 HBx-siRNA上调细胞中IFN-α和IFN-β mRNA含量 将mock-siRNA和HBx-siRNA分别转染至HepG2.2.15细胞，结果显示，与未经处理的HepG2.2.15细胞相比，转染HBx-siRNA的细胞中HBx蛋白表达显著降低（P＜0.01，图2A），而IFN-α和IFN-β mRNA含量显著升高（P＜0.01或P＜0.001，图2B），提示HBV可通过HBx抑制Ⅰ型干扰素信号通路激活。

图2 HBx-siRNA对HepG2.2.15细胞内IFN-α和IFN-β表达的影响Fig.2 Effects of HBx-siRNA on expressions of IFN-α and IFN-β in HepG2.2.15 cells

2.3 pEGFP-HBx通过抑制IRF3的磷酸化影响Ⅰ型干扰素信号通路 将HepG2细胞分别转染空载体质粒pEGFP-N1和pEGFP-HBx，48 h后运用荧光显微镜观察HBx蛋白在细胞中的表达（图3A）。进一步分析各转染细胞中Ⅰ型干扰素mRNA及p-IRF3蛋白的表达，结果显示，与空载体转染的HepG2细胞相比，转染pEGFP-HBx质粒的细胞中p-IRF3蛋白含量降低，IFN-α和IFN-β mRNA水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.01，图3B、C）。

图3 HBx蛋白影响HepG2细胞p-IRF3和Ⅰ型干扰素表达Fig.3 HBx protein affects expressions of p-IRF3 and typeⅠ interferon in HepG2 cells

3 讨论

HBV是一种非细胞病变的嗜肝DNA病毒，可编码多种病毒蛋白，如：DNA多聚酶、表面抗原（HBsAg）、核心抗原（HBcAg）和HBx蛋白［8-9］。肝脏急性感染HBV后，90%～95%的患者能够清除感染并完全康复，其余5%～10%的患者发展为慢性HBV感染，并且部分逐步发展为肝硬化和肝细胞癌［10］。WHO估计全世界约有2.57亿人呈慢性HBV感染，每年有近100万人死于HBV相关并发症［11］。一般认为，HBV感染的结局取决于病毒与宿主免疫系统的相互作用，研究表明，HBV会抑制宿主的免疫系统，表现为先天和适应性免疫细胞功能障碍，而Ⅰ型干扰素在体内具有调节先天免疫反应和激活后天免疫反应的作用［12-13］。此外，尽管常规和聚乙二醇化的IFN-α蛋白已成为慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者的一线治疗药物，且Ⅰ型干扰素的抗病毒作用已明确，但在CHB患者中IFN-α治疗的病毒清除率相当低，具体机制尚未明确［14-15］，因此推测HBV可能影响了Ⅰ型干扰素信号通路。为此，本实验通过对比HepG2细胞和转染HBV全基因组的HepG2.2.15细胞中IFN-α和IFN-β的基因表达量，证实HBV并不能充分诱导肝细胞表达Ⅰ型干扰素，进一步将HBx-siRNA转染至HepG2.2.15细胞发现，抑制肝细胞在病毒转录中维持共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）微型染色体的重要调节蛋白—HBx蛋白的表达，可上调IFN-α和IFN-β的mRNA水平，提示HBx可能抑制了HBV诱导肝细胞表达Ⅰ型干扰素。

Ⅰ型干扰素的产生受到干扰素调节因子（interferon regulatory factors，IRFs）家族的调控，其中，IRF3是Ⅰ型干扰素信号通路的主要调节因子，机体感染病毒后，可通过模式识别受体对病毒病原体相关分子模式进行识别，导致下游转录因子IRF-3的激活和核转位，从而诱导IFN-α和IFN-β的表达［16-17］。而在HBV持续感染的肝细胞中，模式识别受体及IRF3呈低表达，LEE等［18］通过将IRF3小分子激活剂处理HBV感染的细胞，发现激活IRF3可诱导先天免疫作用，抑制HBV cccDNA的形成。在本研究中，将HBV编码的HBx基因表达质粒转染至HepG2细胞，检测结果显示，过表达HBx蛋白的HepG2细胞中IFN-α和IFN-β mRNA表达水平均下降，且磷酸化的IRF3蛋白含量亦降低。

综上所述，本研究通过对培养的肝细胞模型进行HBx基因过表达和沉默，揭示了HBV通过其所编码表达的HBx蛋白抑制IRF3蛋白的活化，从而抑制Ⅰ型干扰素的表达，本实验为进一步探讨HBV感染的慢性化机制以及解决临床CHB患者Ⅰ型干扰素治疗应答不佳提供了新的思路。