蚯蚓多肽的提取纯化工艺及应用研究进展

刘忠慧,周燕代子,王存文

(武汉工程大学化工与制药学院 绿色化工过程教育部重点实验室 新型反应器与绿色化学工艺湖北省重点实验室,湖北 武汉 430205)

蚯蚓又名地龙,为巨蚓科动物参环毛蚓或缟蚯蚓的全体虫,是我国重要的动物类中药材之一。《神农本草经》记载,蚯蚓具有清热、定惊、通络、平喘、利尿的功效;《本草纲目》记载,蚯蚓具有通经活络、活血化瘀、预防心脑血管疾病的功效。蚯蚓是陆地生态系统中生物量最大的无脊椎土壤动物,且生长周期较短,在环保领域具有极大的开发价值。例如在湿地中人工养殖蚯蚓,可去除废水中的TP、TN、COD及重金属Cu、Zn等[1];在污泥中养殖蚯蚓,可去除污泥中的大部分有机物[2],对生态环境起到极大的优化作用。但目前蚯蚓大多以鲜体或干体的形式作为饲料应用于水产和家禽养殖等领域[3],存在利用率较低、附加值不高、浪费严重等问题。因此,提高蚯蚓的利用价值成为目前亟需解决的问题。

蚯蚓含有丰富的营养成分,如氨基酸、有机酸、核苷酸、含氮类物质等[4],其中蛋白含量高达70%,多肽活性成分高达55%～68%[5],在医药和临床方面极具应用价值。因此,蚯蚓多肽的提取纯化受到广泛关注。覃麟等[6]利用Alcalase蛋白酶提取蚯蚓多肽,发现其具有良好的抗氧化性能。Hidayat等[7]利用木瓜蛋白酶提取蚯蚓蛋白中的氨基酸,可用作食品添加剂,极大地提高了蚯蚓蛋白的利用率。刘廷强等[8]利用蚯蚓自溶酶提取蚯蚓中的小分子多肽,发现其能有效提高成人皮肤成纤维细胞和表皮角质形成细胞的活性,可用作化妆品添加剂。在此,作者对蚯蚓蛋白的酶解工艺进行介绍,对蚯蚓多肽纯化工艺的优缺点进行分析,包括层析法、电泳法、膜分离法等,并对蚯蚓多肽在神经系统、呼吸系统、心血管系统、免疫系统、运动系统等方面的药理作用进行综述,拟为蚯蚓多肽的进一步研究和高效利用提供参考。

1 蚯蚓蛋白的酶解工艺

利用外源蛋白酶分解未溶解的蛋白质可以最大限度地提高蛋白质的水解程度,并且不会影响或减少蛋白质中的营养物质[9]。Baehaki等[10]研究证明,酶比化学试剂更加温和,酶解蛋白工艺不会破坏蛋白质中的活性多肽和氨基酸结构,相较于化学水解蛋白工艺更有利于活性物质的提取。此外,蚯蚓蛋白水解得到的多肽多用于药物类研究,而化学试剂的添加会降低多肽作为药物成分的安全性,因此,酶解工艺是目前水解蚯蚓蛋白的最优选择。

酶解法是在特定的温度和pH值下,利用蛋白酶对蛋白质进行水解,将高分子量蛋白质分解成低分子量多肽。不同酶水解蛋白质可以得到不同的生物活性肽,且同一种酶以不同的酶解工艺得到的生物活性肽也会有所差异。因此,针对不同种类的小分子生物活性肽产物,筛选合适的酶及酶解工艺尤为重要。

Alcalase蛋白酶往往被用于提取抗氧化肽和更小分子量的N-氨基化合物,其中抗氧化肽可作为一种优良的天然抗氧化剂,应用于药食两用食品中,而N-氨基化合物作为生物生长的必要营养成分通常用作营养品添加剂[7]。酸性蛋白酶具有极强的水解活性,可以将蚯蚓蛋白水解成分子量更小的氨基酸[11];而弹性蛋白酶和胰蛋白酶可水解蚯蚓蛋白得到含有抑制肺腺癌细胞的多肽物质[12];将胃蛋白酶和胰蛋白酶混合后水解蚯蚓蛋白,得到具有抗凝活性的多肽物质[13];蚯蚓自溶酶作为蚯蚓自身存在的一种水解酶,对蚯蚓中各种活性成分的提取安全性最高,但其水解程度相对较低[14-15]。表1总结了不同酶的酶解工艺。

表1 不同种类酶的酶解工艺

2 蚯蚓多肽的纯化工艺

蚯蚓蛋白酶解后会产生多种不同分子量的活性多肽,往往具有不同的功效,针对不同分子量多肽的纯化尤为重要。常见的蚯蚓多肽纯化工艺主要有层析法、电泳法、膜分离法等。

2.1 层析法

层析法由俄国植物学家Tswett首先提出,是基于待分离物质的理化性质差异建立的分离方法。层析体系由固定相和流动相组成,其中固定相为固体物质或固定于固体物质上的成分,流动相是可以流动的物质,如水或各种溶剂。由于多肽为小分子活性物质,应用于多肽纯化的层析法通常分为凝胶过滤层析法、柱层析法和离子交换层析法等3种。

2.1.1 凝胶过滤层析法

凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法,主要是根据蛋白质质量的大小差异进行分离和纯化,其分离原理如图1所示。

图1 凝胶过滤层析法的分离原理Fig.1 Separation principle of gel filtration chromatography

凝胶过滤层析法所用的凝胶属于惰性载体,不带电荷,吸附力弱,操作条件较温和,可在相当宽的温度范围内进行,不需要有机溶剂。张兰娥等[24]采用凝胶过滤层析法成功提纯了蚯蚓中的活性多肽,发现其对血管紧张素转化酶(ACE)活性有抑制作用。Li等[25]采用凝胶过滤层析法提取了蚯蚓酶解液中的三肽复合物,发现其对HeLa细胞的病变和凋亡起到一定作用,且对正常人类皮肤成纤维细胞的细胞毒性很低,可用于新抗癌化合物的开发。

2.1.2 柱层析法

柱层析法又称柱色谱法,主要是根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数的不同将组分有效分离。相较于其它纯化方法,柱层析法使用的固定相的成本较低,且易处理。杜智勇等[26]通过柱层析法从蚯蚓中提取了谷胱甘肽转硫酶,其比活力达到1.236 U·(mg Pr)-1,纯化倍数达到14倍,收率为17.7%,具有良好的纯化效果。

2.1.3 离子交换层析法

离子交换层析法是在一定pH值条件下,根据蛋白质所带电荷不同来分离蛋白质的一种方法,其分离原理如图2所示。

图2 离子交换层析法的分离原理Fig.2 Separation principle of ion exchange chromatography

离子交换层析法具有操作简单、流动相成本低、蛋白回收率高等优点,尤其对于蚯蚓多肽的纯化,保证其活性尤为重要。李娇等[27]利用CM-22离子交换层析和DEAE离子交换层析实现了蚯蚓葡萄糖氧化酶的纯化,回收率达到60.8%,比活力达到2 684.2 mU·mg-1,纯化倍数达到37.2倍。

2.2 电泳法

电泳法是指在电场作用下,带电荷的供试品(如蛋白质、多肽等)在惰性介质(如纸、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等)中,向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动,使组分分离成狭窄的区带,达到分离纯化的目的。由于多肽的分子量通常在10 kDa以下,常采用毛细管电泳法、双向电泳法纯化多肽。

2.2.1 毛细管电泳法

毛细管电泳法是一类以毛细管为分离通道、高压直流场为驱动力的新型液相分离技术。根据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异实现分离,其分离原理如图3所示。

图3 毛细管电泳法的分离原理Fig.3 Separation principle of capillary electrophoresis

周鑫悦等[28]通过高效毛细血管电泳法同时分离检测出6种蚯蚓多肽,6种蚯蚓多肽可在10 min内达到基线分离。颜松益等[29]通过毛细管电泳-大体积样品堆积法同时富集4种蚯蚓多肽VQ-5、OEP3121、F-1和AQ-5,测得蚯蚓蛋白粉中多肽AQ-5含量为0.0012%,4种蚯蚓多肽的回收率在91.97%～102.67%之间,达到了极好的分离纯化效果。

2.2.2 双向电泳法

双向电泳是等电聚焦电泳(根据pH值分离)和SDS-PAGE电泳(根据分子量大小分离)的组合,其分离原理如图4所示。

图4 双向电泳法的分离原理Fig.4 Separation principle of bidirectional electrophoresis

双向电泳法具有样品不易扩散、用量少、灵敏度高等优点,可以得到更清晰的蛋白质分布图。郭锦等[30]利用SDS-PAGE电泳和双向电泳评价了三氯乙酸-丙酮沉淀法、裂解液法和酚抽提法对蚯蚓总蛋白的提取效果,确定改良后的三氯乙酸-丙酮沉淀法为蚯蚓总蛋白的最佳提取方法。

2.3 膜分离法

膜分离法是指在分子水平上不同粒径分子的混合物通过半透膜实现选择性分离的技术,其分离原理如图5所示。

图5 膜分离法的分离原理Fig.5 Separation principle of membrane separation

对于蚯蚓多肽等热敏性物质,膜分离法能有效减少成分损失,且不改变蚯蚓多肽的物理性质。Fu 等[31]通过中空纤维膜分离-体积排阻色谱法从蚯蚓粗提物中分离纯化出3种高纯度的活性多肽,纯化效率较高。

表2总结了实验室采用的蚯蚓多肽纯化方法的优缺点及主要适用范围,工业上采用的蚯蚓多肽的纯化工艺还需进一步研究。

表2 蚯蚓多肽纯化方法的优缺点及主要适用范围

3 蚯蚓多肽的药理作用

蚯蚓多肽中的多种活性成分具有不同的药理作用,目前具有抗氧化和抗凝血作用的蚯蚓小分子活性肽在神经系统和免疫系统中的应用较为成熟。

3.1 对神经系统的作用

蚯蚓中的有效成分抗凝肽、溶栓肽和纤维酶[15]等可通过抗凝、溶栓、调节纤溶系统平衡等机制,抑制血栓形成,改善脑循环[32]。蚯蚓中的蚓激酶(LK)具有类似纤溶酶原激活物的作用,联合氯吡格雷可治疗短暂性脑缺血发作,并对糖尿病有明显疗效[33]。癫痫作为一种神经系统综合征,其发作主要与中枢神经系统内的兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸之间的平衡失调有关,蚯蚓不仅可以降低兴奋性谷氨酸的含量,同时可以提高抑制性氨基丁酸的水平,改善兴奋性与抑制性氨基酸神经递质的平衡失调,从而延长癫痫发作的潜伏时间[34]。蚯蚓中的蚓激酶、不饱和脂肪酸等成分对血管性痴呆、阿尔兹海默症等神经系统疾病均可以起到不错的治疗效果[35]。

3.2 对呼吸系统的作用

张胜碧等[36]研究发现,高剂量蚯蚓提取液与地塞米松结合使用能显著降低基质金属蛋白酶(MMP)2/基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1值(P<0.05),通过调节MMPs/TIMP-1平衡,对哮喘小鼠气道重塑具有一定的改善作用;蚯蚓提取液通过改善气道炎症、抗阻胺、舒张支气管等作用,以缓解支气管痉挛,从而发挥平喘的作用。汪磊等[37]将蚯蚓与其它中药搭配使用,对不同程度的哮喘都有一定的缓解作用。

3.3 对心血管系统的作用

赵信科等[38]研究发现,地龙降压胶囊通过抑制RAAS系统过度激活及TGF-1、VEGF等蛋白的表达从而发挥明显的降压作用,从蚯蚓中提取的次黄嘌呤已在临床上用作降压药的有效成分。蚯蚓中提取的抗菌活性肽能有效抑制牙龈卟啉单胞菌的生长,预防牙周炎的发生[39]。此外,蚯蚓多肽与疏血通结合,通过激活MYPT1/LIMK1/Cofilin通路以促进缺血后血管的生成,有效改善缺血问题[40]。

3.4 对免疫系统的作用

蚯蚓提取液通过抑制JAK-STAT3通路,从而抑制结肠癌移植瘤的生长及血管新生[41];蚯蚓提取液通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化,预防结肠炎后结肠癌的发生与发展[42];蚯蚓提取液中还含有抑制肺腺癌细胞的活性成分[12];蚯蚓组织中存在既可抑制肿瘤细胞生长,又可促进骨髓原始细胞增殖造血的活性物质,能够改善血液流变,从而改善全身各组织器官代谢[43];蚯蚓中提取的抗氧化酶可有效清除氧自由基,阻断过氧化反应,从而修复受损部位,加速创面愈合[44];此外,蚯蚓多肽还可调控炎症因子表达,抑制炎症反应,从而改善炎症损伤[45]。

3.5 对运动系统的作用

G-90是一种从蚯蚓中提取的蛋白肽[46],含有多种生长因子,可以促进成骨细胞的分化和增殖,增强基质钙沉积能力,提高碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙素的表达水平。Hussain等[47]从分子量大小和氨基酸组成等方面对从蚯蚓中提取的6种抗菌肽进行了评价,发现其中1种抗菌肽可以提高神经元增殖能力,改善运动功能障碍和多巴胺神经退行性病变[44]。

3.6 止痛类作用

古籍中早有记载,VQ-5和AQ-5是从蚯蚓中提取的2种具有镇痛和抗炎作用的多肽[48],通过抑制具有镇痛和抗炎功能的丝裂原激活蛋白激酶信号通路,表现出良好的镇痛作用,是一种新型镇痛药物成分。徐杰等[49]研究发现,抗炎消肿药颈腰康胶囊的有效成分来源于蚯蚓提取液中的多肽类活性物质。包银萍等[50]通过动物实验及人体安全性评价证明,蚯蚓多肽对皮肤无刺激,具有良好的抗炎、抗敏、修复等功效,可作为安全无刺激的化妆品原料。

3.7 其它作用

由于蚯蚓多肽的成分复杂,许多学者对蚯蚓多肽的成分及药理功效进行了大量研究[51-55]。除了上述作用外,蚯蚓多肽提取液也可作为一种全方位的特效药应用于临床试验,在胃溃疡、抗疲劳、预防高脂、降脂、解热、抗惊厥等方面都有一定的功效。

4 结语

我国蚯蚓资源丰富,利用牛粪、秸秆、污泥等农业废弃物养殖蚯蚓,具有显著的经济效益和环保效益。酶解法由于条件温和且不会破坏蛋白质中的活性多肽和氨基酸结构,更有利于蚯蚓活性多肽的提取。针对不同种类酶,蚯蚓蛋白的最佳酶解工艺还需进行具体探索。蚯蚓多肽作为一种新的生物制剂,在神经系统、心血管系统等方面疾病的治疗中发挥重要作用,地龙注射液、多肽地龙蛋白等多肽类产品已应用于临床。由于蚯蚓多肽的成分较为复杂,目前针对不同活性蚯蚓多肽的提取和纯化还处在发展阶段,广泛使用的多肽纯化方法主要有层析法、电泳法和膜分离法等,但上述方法仅限于实验室研究阶段,未有成熟的工业化应用。对于蚯蚓多肽中的活性成分的应用也还处于探索阶段,多数活性成分尚未在临床上验证,因此,蚯蚓多肽具有十分广阔的开发应用前景。