黄微孢属真菌改善盐碱胁迫下绿豆生长作用分析

马晨曦 张 瑜 孔德馨 高 颖 徐利剑 孟 威*

（1.东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室（东北林业大学），哈尔滨 150040； 2.黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨150080）

盐碱地是我国极为重要的后备耕地资源，通过技术手段提高植物适应盐碱地的能力是盐碱地开发利用的重要手段［1］。植物与有益微生物共生是提高植物耐盐碱能力重要途径之一［2-3］。盐碱胁迫下，植物共生真菌能够改变根系结构、将Na+外排、限制Na+向地上组织运输、维持K+稳态、提高寄主植物营养元素吸收，以及水分运输能力、保护光合作用系统、降低植物体内活性氧积累、增加以脯氨酸和可溶性糖为代表的渗透物质含量，从而降低氧化和渗透胁迫损伤［4-8］。因此，挖掘更多的有益真菌资源用于提高植物耐盐碱能力将为提升盐碱地的利用力度提供支持。

绿豆（Vigna radiata）是豆科（Fabaceae）豇豆属（Vigna）一年生草本植物，是我国传统杂粮植物。绿豆营养丰富，具高蛋白、高淀粉、高纤维、高矿物质元素和维生素且低脂肪特点。此外，它富含总多酚、总黄酮和多糖等活性物质，在抗氧化、降血脂、调节血糖等方面发挥作用［9］。在中国南北各地均有种植绿豆广泛种植于热带和亚热带地区，中国是绿豆的主要出口国之一。尽管绿豆具有一定耐盐性，但是盐胁迫依然会通过降低种子发芽率、根冠长、鲜质量和幼苗活力等方式导致绿豆产量显著下降［10］。

黄微孢属（Parametarhizium）是2021 年从中国东北森林凋落物中分离培养出来的1 个子囊菌门（Ascomycota）麦角菌科（Clavicipitaceae）新菌属，包含2 个新物种，根据其样品来源地，分别命名为长白黄微孢菌（P.changbaiense）与兴安黄微孢菌（P.hingganense）［11］。研究发现兴安黄微孢菌可以定殖于绿豆根表面及细胞间隙，形成共生关系，促进绿豆生长并提高对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的绿豆猝倒病的抗病性［12］。然而，黄微孢属真菌是否像其近缘属绿僵菌属（Metarhizium）真菌一样具有提升植物耐非生物胁迫能力，尤其是抗盐碱胁迫，尚不明确。

为了研究黄微孢属真菌是否能够提高植物耐盐碱胁迫能力，本研究对黄微孢属真菌处理后的绿豆植株分别进行不同浓度的盐碱胁迫处理，分析植株表型和光合特性差异，检测渗透性调节物质、活性氧含量、脂质过氧化程度及保护性酶活性变化，明确黄微孢属2种真菌是否能够改善盐碱胁迫下绿豆生长，为开发黄微孢属真菌作为盐碱地植物有益真菌菌剂提供理论基础，同时为利用盐碱地进行绿豆种植提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料

绿豆品种为绿丰2号，由黑龙江省农业科学研究院齐齐哈尔分院郑旭助理研究员提供。

长白黄微孢菌（CGMCC 19144）和兴安黄微孢菌（CGMCC 19143）由黑龙江大学徐利剑教授提供。

酵母麦芽浸粉培养基（Yeast extract and Malt extracts，YM）：酵母浸粉3 g，麦芽浸粉3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH为5～6。

1.2 方法

1.2.1 黄微孢属真菌处理绿豆

黄微孢属真菌孢子悬浮液制备：黄微孢属真菌在YM 培养基上室温生长14 d。将2 mL 无菌水加入至平板，用无菌棉签刮蹭表面，在新YM 培养基上进行Z 字型涂抹，室温培养7～10 d。将30 mL无菌水倒入平板，用棉签充分刮蹭表面，将孢子悬浮液用无菌双层纱布过滤，使用血球计数板将孢子悬浮液定量为1×108个·mL-1。

挑选大小一致、饱满的绿豆种子，真菌处理组用黄微孢属真菌孢子悬浮液浸泡（以孢子液刚没过种子为标准），未处理组用无菌水浸泡。种子在黑暗条件下25 ℃浸泡24 h 后转移至16 h 昼/8h 夜光周期条件下继续在孢子液中培养至胚根长度为1.5 cm。挑选长势一致的绿豆种植于装有灭菌土壤（V（腐殖土）∶V（蛭石）=1∶1）的花盆（外径7.4 cm×高6.2 cm）中，每盆种植1 棵幼苗，每种处理种植28盆。在25 ℃，16 h昼/8h夜光周期条件下培养。

1.2.2 盐、碱胁迫处理

盐碱胁迫处理参照刘杰等［13］方法。按照摩尔比n（NaCl）∶n（Na2SO4）=9∶1 和n（NaHCO3）∶n（Na2CO3）=9∶1 分别配置中性盐溶液和碱性盐溶液。中性盐胁迫（盐胁迫）和碱性盐胁迫（碱胁迫）设置浓度梯度为0（对照）、15、30、45、60 mmol·L-1。15～60 mmol·L-1碱性盐溶液pH 分别为9.55、9.54、9.53、9.50。绿豆生长至4～5 cm 时，每盆绿豆每天固定浇灌50 mL 的中性盐或碱性盐溶液，共处理10 d。

1.2.3 测定指标与方法

采集经0～60 mmol·L-1盐、碱胁迫后绿豆植株地上和地下样品，测量株高、根长和总生物量，每种处理测量10 株。利用光合仪（Li-6800，美国）测定对照和60 mmol·L-1盐、碱胁迫绿豆植株的气体交换参数，包括叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间二氧化碳摩尔分数（Ci）和蒸腾速率（Tr），每种处理测定20 株。光合仪测定参数设置：叶室温度25 ℃，二氧化碳摩尔分数400 µmol·mol-1，空气相对湿度60%～70%，光强1 000 µmol·m2·s-1。利用FluorCam叶绿素荧光成像仪（FC 800-O，捷克）对绿豆复叶叶片暗适应最小荧光（Fo）、暗适应最大荧光（Fm）和PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）进行测定；测定前将植株置于黑暗中30 min，每种处理测定15株。

针对对照和60 mmol·L-1盐、碱胁迫后绿豆植株，参照苍晶等［14］方法对以下指标进行测定，叶绿素含量采用乙醇提取法、脯氨酸测定采用磺基水杨酸法、可溶性糖采用蒽酮法、超氧阴离子和过氧化氢含量分别采用羟胺氧化法和碘化钾法、丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法、POD 活性采用愈创木酚法、SOD 活性采用氮蓝四唑法、CAT 活性采用分光光度法。每种处理3 个重复，每个重复由2株植物组成。

1.3 数据分析

利用Microsoft Excel 2019 及GraphPad Prism 9.5.1 整理数据和作图，采用Two-way ANOVA 对2种真菌处理和未处理植株在盐、碱胁迫下各指标间差异显著性进行分析，结果用平均值±标准差表示，图表中不同字母表示差异显著性（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 黄微孢属真菌处理对盐碱胁迫下绿豆植株生长表型的影响

在无胁迫条件下，不同处理植株生长表型存在差异，其中地上及根鲜质量由高到低依次为兴安黄微孢菌处理、长白黄微孢菌处理、未处理植株（见图1），说明2 种真菌具有促进绿豆植株生长的作用，且兴安黄微孢菌促生能力强于长白黄微孢菌。

随着盐胁迫浓度升高，未处理植株地上和根鲜质量显著下降（P＜0.001）。尽管2 种真菌处理植株地上鲜质量显著下降（P＜0.001），但是45～60 mmol·L-1胁迫的根鲜质量无显著降低。与未处理植株相比，60 mmol·L-1胁迫的长白黄微孢菌处理植株地上部分鲜质量增加80.5%，根鲜质量增加30.8%，兴安黄微孢菌处理植株地上部分鲜质量增加104.1%，根鲜质量增加37.7%。不同浓度盐胁迫下各处理植株株高和根长差异较小（见图1A，图2A）。

随着碱胁迫浓度升高，不同处理植株地上和根鲜质量显著下降（P＜0.001）。与未处理植株相比，60 mmol·L-1胁迫下长白黄微孢菌处理植株地上部分鲜质量增加44.5%，根鲜质量增加43.2%，兴安黄微孢菌处理植株地上部分鲜质量增加33.4%，根鲜质量增加85.5%。不同浓度碱胁迫对长白黄微孢菌处理株高和兴安黄微孢菌处理根长无影响（见图1B，图2B）。

以上结果说明2 种真菌处理能够不同程度地缓解高浓度盐、碱胁迫对绿豆生长的影响，且盐胁迫下兴安黄微孢菌处理效果优于长白黄微孢菌处理，而碱胁迫下长白黄微孢菌处理对地上部分有较好的改善效果，而兴安黄微孢菌处理对根生长有较好改善效果。

2.2 黄微孢属真菌处理对盐碱胁迫下绿豆光合作用的影响

无胁迫条件下，2种真菌处理植株总叶绿素质量分数（长白黄微孢菌：（0.680±0.005） mg·g-1；兴安黄微孢菌：（0.770±0.008） mg·g-1）显著高于未处理植株（0.570±0.007） mg·g-1）（P＜0.001），并且兴安黄微孢菌处理显著高于长白黄微孢菌处理（P＜0.001）。2 种真菌处理植株净光合速率（Pn）、胞间二氧化碳摩尔分数（Ci）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）显著增加，其中，Pn、Gs和Tr约为未处理植株2 倍（见表1）。盐、碱胁迫下各处理绿豆植株Pn、Ci、Gs和Tr均呈下降趋势，但是2 种真菌处理植株以上各项指标均显著高于未处理植株（P＜0.001），其中盐胁迫下各指标能够维持与无胁迫下未处理植株相近水平。盐、碱胁迫下2种真菌处理植株Pn仍显著高于无胁迫下未处理植株水平（P＜0.001），盐胁迫下2 种真菌处理植株Pn无显著差异，但碱胁迫下长白黄微孢菌处理植株Pn显著高于兴安黄微孢菌处理植株（见表1）。

表1 盐碱胁迫下黄微孢属真菌处理对植株光合指标的影响Table 1 Effects of the treatment of fungi from Parametarhizum on the photosynthetic indexes under salt and alkali stress

无胁迫条件下，真菌处理植株PSⅡ潜在活性（Fv/Fo）显著增加，PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）无显著差异。尽管盐、碱胁迫使不同处理植株Fv/Fo和Fv/Fm比值下降，但2 种真菌处理植株Fv/Fo和Fv/Fm比值仍高于未处理植株（P＜0.001），并且盐胁迫下兴安黄微孢菌处理植株Fv/Fm比值显著高于长白黄微孢菌处理（P＜0.001），碱胁迫下长白黄微孢菌处理植株Fv/Fo和Fv/Fm比值显著高于兴安黄微孢菌处理植株和未处理植株（P＜0.001）（见图3）。

图3 盐碱胁迫下黄微孢属真菌处理植株叶绿素荧光Fig.3 Chlorophyll fluorescence of plants treated with fungi from Parametarhizum under salt and alkali stress

2.3 盐碱胁迫下黄微孢属真菌处理绿豆植株渗透调节物质含量变化

无胁迫条件下2 种真菌处理植株根部脯氨酸质量分数显著高于未处理植株（P＜0.001），地上部分差异较小，兴安黄微孢菌处理植株脯氨酸质量分数显著低于其他2 种处理（P＜0.001）（见图4A），而不同处理间可溶性糖质量分数无差别（见图4B）。盐胁迫使各处理脯氨酸质量分数均显著增加（P＜0.001），然而2 种真菌处理植株地上部分脯氨酸质量分数均显著高于未处理植株，长白黄微孢菌处理下增加了26.2%，兴安黄微孢菌处理下增加了43.1%。与未处理植株根部脯氨酸质量分数相比，兴安黄微孢菌处理下增加了50%，长白黄微孢菌处理植株无显著变化（见图4A）。可溶性糖质量分数则无显著变化（见图4B）。碱胁迫同样导致各处理脯氨酸质量分数显著增加。尽管2 种真菌处理植株脯氨酸质量分数均显著高于未处理植株，但是长白黄微孢菌处理植株地上部分约为未处理植株2 倍（见图4A）。长白黄微孢菌处理植株地上部分可溶性糖质量分数同样显著高于未处理植株（P＜0.001）（见图4B）。

以上结果表明，2种真菌处理能够影响植株渗透调节物质含量，兴安黄微孢菌处理导致盐胁迫下根部脯氨酸积累，而长白黄微孢菌处理提高碱胁迫下地上部分脯氨酸和可溶性糖积累水平。

2.4 盐碱胁迫下黄微孢属真菌处理绿豆植株活性氧及抗氧化酶含量变化

无胁迫条件下，除兴安黄微孢菌处理植株地上部分H2O2含量显著低于其他两种处理之外，2种真菌处理植株O·-2与H2O2含量与未处理植株无显著差异。盐胁迫兴安黄微孢菌处理植株地上部分O·-2与长白黄微孢菌地上部分H2O2含量显著低于未处理植株（P＜0.001）。与盐胁迫相比，碱胁迫显著诱导未处理植株O·-2与H2O2积累，但2 种真菌处理植株整体O·-2和根部H2O2水平显著低于未处理植株（P＜0.001）（见图5A～B）。MDA 含量分析显示，尽管无胁迫条件下兴安黄微孢菌和长白黄微孢菌处理植株地上部分显著高于未处理植株，但盐、碱胁迫下两种真菌处理植株整体MDA 水平显著低于未处理植株（P＜0.001）（见图5C）。

图5 盐碱胁迫下黄微孢属真菌处理植株活性氧、MDA含量及抗氧化酶活性Fig.5 Contents of ROS，MDA and antioxidant enzymes activities of plants treated with fungi from Parametarhizum under salt and alkali stress

2 种真菌处理对抗氧化酶活性也有不同程度影响，无胁迫下POD无显著变化，但根部SOD和地上部分CAT 活性显著升高（P＜0.001）。盐、碱胁迫导致各处理整株POD、SOD 和根部CAT 活性增加，但两种真菌处理植株盐胁迫下SOD 活性和地上部分CAT 活性显著高于未处理植株，碱胁迫下两种真菌地上部分SOD 活性和长白黄微孢菌处理根部POD、SOD活性显著高于未处理植株（P＜0.001）（见图5D～F）。综合以上结果说明，盐、碱胁迫下两种真菌处理植株活性氧水平和脂质过氧化程度较低，POD、SOD 和CAT 活性在盐碱胁迫下均有不同程度地改变。

3 讨论

随着盐碱地综合利用力度加大，大量适应盐碱地环境的微生物资源被开发利用，在生态环境修复和农业生产中发挥重要作用［15］。本研究发现来自中国东北森林凋落物的兴安黄微孢菌和长白黄微孢菌处理绿豆种子后，能够改善后期植株在盐、碱胁迫下的生长。

3.1 黄微孢属真菌处理改善绿豆对盐碱胁迫的生理生化响应

盐碱环境对植物的胁迫体现在生物量下降、光合作用减弱、离子动态平衡紊乱、膜透性增加等方面［2］。在本研究中，2 种黄微孢属真菌处理植株在无胁迫条件下光合气体交换参数（净光合速率、胞间二氧化碳摩尔分数、气孔导度、蒸腾速率）、叶绿素含量、PSⅡ潜在活性和最大光化学效率显著提升且趋势一致，说明2种真菌处理可以提升绿豆光合能力，并可能为生物量显著提升提供基础。在盐胁迫下，尽管2种真菌处理植株光合气体交换参数出现下降，但能够维持与无胁迫条件下未处理植株相似水平，碱胁迫下长白黄微孢菌处理净光合速率依然维持高于兴安黄微孢菌处理和未处理植株水平，意味着2种真菌处理可能缓解了气孔限制所导致的光合作用下降。与此同时，2种真菌处理减缓盐、碱胁迫下PSⅡ潜在活性和最大光化学效率下降。以上研究结果与丛枝菌根真菌和外生菌根真菌共生的植物表现一致。盐胁迫下丛枝菌根真菌提高植物光合速率、叶绿素荧光和含量、气孔导度、抗氧化代谢及维护离子平衡等［5，7，16］。外生菌根真菌（Scleroderma bermudense）与海葡萄（Coccoloba uvifera）共生，通过提高气孔导度和气体交换能力来提高盐胁迫下植物的光合能力［17］。厚环乳牛杆菌（Suillus grevillea）与美味牛肝菌（Boletus edulis）与蒙古栎（Quercus mongolica）共生同样能够缓解盐胁迫下植物叶片损伤并保持较高光合活性［18］。由此可见，黄微孢属2种真菌可能利用与丛枝菌根真菌和外生菌根真菌相似的策略维护光合能力改善盐碱胁迫下绿豆的生长。

黄微孢属与绿僵菌属具有较近的亲缘关系［11］。鉴于二者位于一个单系类群且具有相似的杀虫活性和促生能力等［11-12］，黄微孢属真菌可能具有其他与绿僵菌属真菌相似的功能。金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）LHL07 接种大豆（Glycine max）后能有效促进茎生长，干质量和鲜质量增加，叶绿素含量、呼吸速率、光合速率和叶面积增加。在NaCl 引起的盐胁迫下，LHL07 接种的大豆植株具有较高脯氨酸含量和SOD 活性以及MDA 水平，说明金龟子绿僵菌LHL07 能够有效缓解盐胁迫对大豆植株的损伤［19］。在本研究中，通过对表型、光合作用相关指标，以及渗透和氧化胁迫相关指标分析得出黄微孢属2 种真菌与金龟子绿僵菌类似，均能不同程度地缓解盐碱环境对绿豆植株的胁迫。

3.2 不同黄微孢属真菌处理对绿豆耐盐碱胁迫影响差异

在盐碱胁迫下，2种真菌处理植株脯氨酸含量显著增加，兴安黄微孢菌处理根部脯氨酸含量在盐胁迫下显著高于长白黄微孢菌处理，而长白黄微孢菌处理地上部分脯氨酸含量在碱胁迫下显著高于兴安黄微孢菌处理。长白黄微孢菌处理地上部分可溶性糖含量在碱胁迫下显著升高。由此可推测，尽管2种真菌均能够通过渗透调节来改善盐碱胁迫影响，但是它们的作用机理可能存在差异，即兴安黄微孢菌可能主要影响根部，而长白黄微孢菌可能主要影响地上部分。MDA含量能够反映胁迫下生物膜受损程度，在本研究中盐碱胁迫下2种真菌处理植株中ROS、MDA含量显著下降，而抗氧化酶活性不同程度上调，意味着2种真菌处理植株抗氧化胁迫能力提升，而二者间差异说明2种真菌处理植株应对氧化胁迫机制不同。

兴安黄微孢菌能够在绿豆根表面及细胞间隙定殖，与绿豆根形成共生关系，并且通过促进磷吸收和改变激素水平促进绿豆的生长［12］。在本研究中，尽管盐、碱胁迫导致植物萎蔫并抑制植物的生长，但是与未处理植株相比，兴安黄微孢菌处理植株在盐胁迫下具有较高生物量，在碱胁迫下根部鲜质量显著增加。以上结果说明兴安黄微孢菌在高盐碱环境下仍能够发挥促进植物生长的作用。尽管长白黄微孢菌是否能够与绿豆形成共生关系鲜见报道，但是在无胁迫条件下表型分析结果显示，长白黄微孢菌能够显著提高根、地上部分鲜质量，说明长白黄微孢菌也具有潜在的促生能力。虽然在盐胁迫下长白黄微孢菌的促生效果低于兴安黄微孢菌，但是随着盐浓度升高，长白黄微孢菌对绿豆生长的改善作用逐渐显著。相反，在碱胁迫下长白黄微孢菌处理后的绿豆在地上鲜质量、株高、光合指标和叶绿素荧光参数等方面优于兴安黄微孢菌处理。综合以上多方面结果说明，长白黄微孢菌和兴安黄微孢菌可能通过不同的机制维护光合能力、提升渗透和抗氧化调节能力，进而改善盐碱胁迫下绿豆的生长。

黄微孢属作为子囊菌门新发现菌属，目前只包含2个菌种，对该属真菌生物活性的了解尚处于初始阶段。因此，本研究将中性盐和碱性盐胁迫分开处理，预期发现2 种真菌在盐、碱胁迫下对植物的效应和不同之处。研究结果显示：2种真菌能够从植物生理生化多方面减缓盐碱胁迫对绿豆生长的影响，并且2 种真菌处理植株在盐、碱胁迫下出现差异。尽管本研究在绿豆幼苗阶段开始进行胁迫处理，并不适用于生产实践中盐碱地种植情况，但是本研究结果为开发利用黄微孢属真菌作为盐碱地有益微生物菌肥提供理论基础。在未来研究中，将从黑龙江省盐碱地类型出发，探索更适用于大田种植的真菌处理方式，为进一步拓展黄微孢属真菌的适用范围提供支持。