miR-141-3p靶向MYT1L促进结肠癌细胞的恶性进展

肖杨斌 方铠宁

1 湖南省岳阳市人民医院胃肠外科 414000; 2 岳阳市妇幼保健院妇科

结肠癌(Colon cancer,CC)是临床上常见的消化道恶性肿瘤,在全球的发病率一直很高,每年导致大量死亡,排在恶性肿瘤和致死病因的第四位,已成为严重威胁人类身体健康的恶性肿瘤之一[1]。尽管已经开发了综合治疗方案,但结肠癌的预后仍不理想,这可能归因于缺乏早期诊断和有效的靶向药物[2]。miRNA是短的非编码RNA分子,由20～24个核苷酸组成,其主要通过完全或不完全结合靶基因的3’-UTR来调节基因表达[3]。近年来的研究表明,部分miRNA可能是结肠癌的候选预后和诊断生物标志物[4]。研究表明miR-141-3p对肺腺癌[5]、鼻咽癌[6]细胞的迁移、增殖、凋亡活动等都存在调控作用。MYT1L是一小组紧密相关的锌指转录因子家族的成员,先前有研究表明,miR-338-3p可通过靶向MYT1L而抑制胶质瘤细胞增殖[7]。目前对miR-141-3p和MYT1L在结肠癌中的机制研究较少。本研究以结肠癌细胞为体外研究对象,探讨miR-141-3p靶向调控MYT1L对结肠癌细胞的恶性进展的影响,从而探究miR-141-3p和MYT1L在结肠癌中的调控机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 正常人结肠上皮细胞CCD841CON、人结肠癌细胞系HCT8、SW480和HCT116购自中国北纳生物。胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)购自美国Invitrogen公司;青霉素和链霉素、DMEM培养基、MEM培养基、Lipofectamine2000试剂购自美国Gibco公司;Trizol、结晶紫购自美国Thermo Fisher Scientific公司;qScript cDNA合成试剂盒购自美国Quantabio公司;miScript SYBR Green PCR试剂盒购自德国Qiagen公司;所有引物均购自上海生工生物工程有限公司;CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司;Annexin V-FITC凋亡试剂盒购自美国Biovision公司;phRL-SV40对照载体购自美国Promega公司;24孔Transwell室购自美国Corning公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液购自中国索莱宝公司;MyT1L兔多克隆抗体、GAPDH兔单克隆抗体、山羊抗兔IgG H&L(HRP)购自英国Abcam公司、NC膜购自美国Millipore公司;ECL试剂盒购自中国碧云天公司;流式细胞仪购自国BD Biosciences公司。

1.2 生物信息学方法 从TCGA数据库下载TCGA-COAD的mRNA、miRNA表达量数据,利用edgeR进行差异分析(|logFC|>2,Padj<0.05)。并对差异miRNA进行生存分析,确定研究的目标miRNA。利用TargetScan、miRDB两个数据库对目标miRNA进行靶向预测,并与差异mRNA取交集,获得与目标miRNA具有靶向结合位点的差异mRNA。

1.3 细胞培养 人结肠癌细胞系HCT8、SW480和HCT116在含有10%FBS,100μg/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM培养基中培养。正常人结肠上皮细胞CCD841CON在含有10%FBS的MEM培养基中培养。所有细胞均在37℃的含5%CO2的培养箱中培养。

1.4 细胞转染及载体质粒构建 细胞按1.2×106/孔接种至6孔板中,待生长至对数期时,将NC mimic和miR-141-3p mimic分别经Lipofectamine2000试剂瞬时转染到各组结肠癌细胞中,并在含有5% CO2、37℃的培养基中培养,6h后更换培养基继续培养48h进行后续实验。利用慢病毒包装构建MYT1L的表达载体。合成带有KpnI和XhoI限制性酶切位点的MYT1L cDNA(pUC-MYT1L)和其对照序列pUC-NC序列(序列由BLOCK-iTTMRNAi Deshgner网站设计),使用T4连接酶将其连接到慢病毒表达载体pLVX-IRES-neo 上并转染受体细胞。

1.5 qRT-PCR检测 用Trizol从细胞中提取总RNA。使用qScript cDNA合成试剂盒将1μg的miR-141-3p和MYT1L总RNA分别用于合成cDNA,使用miScript SYBR Green PCR试剂盒进行定量PCR。内参物为U6和GAPDH。PCR条件为:95℃ 2min,接着95℃ 5s和60℃ 30s循环40次。结果用2-ΔΔCt值来比较对照组和实验组的目的基因miRNA相对表达量的差异,实验重复3次。qRT-PCR引物见表1。

表1 qRT-PCR引物列表

1.6 CCK-8检测细胞增殖 用CCK-8试剂盒进行细胞增殖测定。将结肠癌细胞系HCT8的细胞以6×105个细胞/孔的密度接种在24孔板中,每孔500μl。细胞在37℃、5%CO2环境下培养。在培养0h、24h、48h和72h时,向每孔加入50μl CCK-8溶液,继续培养4h后,检测450nm处OD值。

1.7 通过流式细胞术评估HCT8细胞的凋亡率 在6孔板中以2×104个细胞/孔的浓度培养HCT8细胞,并用pUC-MYT1L转染。培养48h后,将细胞用胰蛋白酶(不含EDTA)消化,然后收集并重悬于PBS(4℃)中。在4 ℃条件下以1 000r/min的转速离心细胞并去除PBS后,加入结合缓冲液(1×)重悬细胞,然后,加入膜联蛋白V-FITC凋亡试剂盒中的膜联蛋白V-FITC(Biovision,K101)和PI避光染色15min。流式细胞仪(BD Biosciences)用于检测细胞凋亡率。

1.8 双荧光素酶检测miR-141-3p和MYT1L的靶向性 将HCT8细胞以6×105个细胞/孔接种在24孔板中并孵育24h。随后,用0.8μg pGL3-MYT1L-3’UTR和pGL3-MYT1L-3’UTR Mut质粒,用phRL-SV40对照载体共转染细胞,然后使用Lipofectamine 2000试剂盒将miR-141-3p mimic及其阴性对照分别转染到细胞中。在转染后24h使用双荧光素酶测定法检测海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶活性,实验重复3次。

1.9 Transwell检测细胞迁移 将大约2×104个细胞加入24孔Transwell小室上室中。将含有10%FBS的DMEM培养基填充到下室中。在37 ℃温育24h后,弃去培养基,PBS洗涤小室3次,用棉签涂敷器除去未通过膜的细胞,随后用4%多聚甲醛固定,并对膜下表面的细胞进行结晶紫染色,显微镜下观察并拍照。

1.10 Western blot检测MYT1L蛋白表达量 细胞转染48h后,将各组细胞使用冷PBS洗涤3次,随后加入RIPA裂解液,置于冰上裂解10min。采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量,随后加入10μl上样缓冲液于95℃煮10min后,于100V条件进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结束后,在100mA条件下,将蛋白转移(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)至NC膜,封闭液(5% BSA/TBST)封闭60min,加入一抗,4℃过夜孵育,内参为GAPDH。一抗:MYT1L(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)。一抗孵育完毕后,用1×TBST溶液洗膜3次,每次5min,加辣根过氧化酶标记的二抗:山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶10 000),室温下孵育120min,1×TBST洗膜3次,每次20min。用ECL试剂盒对蛋白样品进行显影,观察蛋白印记,并进行图像分析。用Quantity One软件分析条带灰度值,检测MYT1L的相对表达量,用目的条带与内参条带灰度值之比来表示。实验重复3次。

1.11 统计学方法 所有数据均采用SPSS22.0统计学软件进行处理,计量资料采用均值±标准差的形式表示,两组间比较为t检验,多组间的比较应采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-141-3p在结肠癌中的表达情况 edgeR差异分析结果显示,一共获取299个差异miRNA和2 065个差异mRNA (见图1a)。其中,结肠癌组织中的miR-141-3p的表达水平显著高于正常组织(P<0.05,见图1b)。生存分析结果显示,结肠癌组织中miR-141-3p高表达患者的总生存时间显著低于低表达患者(见图1c)。qRT-PCR检测人结肠癌细胞HCT8、SW480和HCT116和正常人结肠上皮细胞CCD841CoN中 miR-141-3p的表达量。结果表明,miR-141-3p在人不同结肠癌细胞中表达均显著高于人正常细胞(见图1d)。选择相对表达较高的HCT8细胞进行后续实验。

图1 miR-141-3p在结肠癌中表达量高

2.2 miR-141-3p高表达对细胞表型的影响 CCK-8检测结果显示,miR-141-3p mimic组的细胞增殖能力显著高于NC mimic组(P<0.05,见图2a)。Transwell实验结果显示,miR-141-3p mimic组的细胞迁移能力显著高于NC mimic组(P<0.05,见图2b)。miR-141-3p mimic组的细胞凋亡率显著低于NC mimic组(P<0.05,见图2c)。综上,miR-141-3p的高表达会促进细胞的恶性表型。

图2 过表达miR-141-3p导致HCT8细胞表型恶化

2.3 miR-141-3p与MYT1L在结肠癌细胞中的关系 利用TargetScan、miRDB两个数据库对miR-141-3p进行靶基因预测,并与下调的903个差异mRNA取交集,获得38个与miR-141-3p具有靶向结合位点的靶基因 (见图3a)。其中,miR-141-3p与MYT1L具有显著的负相关性(见图3b)。MYT1L在结肠癌组织中呈现极显著的低表达(图3c)。在HCT8细胞系中用qRT-PCR和Western blot检测转染NC mimic和miR-141-3p mimic后,MYT1L的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,与NC mimic组相比,miR-141-3p mimic组的MYT1L的mRNA和蛋白表达水平均显著下调(P<0.05,见图3d～e)。随后,利用双荧光素酶验证靶向关系。与MYT1L-W+NC mimic共转染组相比,MYT1L-W+miR-141-3p mimic共转染组荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而MYT1L-M+miR-141-3p mimic共转染组的荧光素酶活性与MYT1L-M+NC mimic共转染组无显著差异(P>0.05,见图3f),表明miR-141-3p可能与MYT1L的3’UTR结合。综合上述结果可知miR-141-3p与MYT1L之间存在靶向调节关系。

图3 miR-141-3p靶向下调MYT1L的表达

2.4 miR-141-3p与MYT1L共同作用对结肠癌细胞表型的影响 将HCT8细胞分组为:pUC-NC+NC mimic组、pUC-MYT1L+NC mimic组、pUC-MYT1L+miR-141-3p mimic组。CCK-8实验结果显示,pUC-MYT1L+NC mimic组细胞活性显著低于pUC-NC+NC mimic组(均P<0.05),而pUC-MYT1L+miR-141-3p mimic组细胞活性显著高于pUC-MYT1L+NC mimic组(均P<0.05,见图4a)。Transwell实验结果显示,pUC-MYT1L+NC mimic组细胞迁移能力显著低于pUC-NC+NC mimic组(P<0.05),而pUC-MYT1L+miR-141-3p mimic组细胞迁移能力显著高于pUC-MYT1L+NC mimic组(P<0.05,见图4b)。细胞凋亡实验结果显示,pUC-MYT1L+NC mimic组细胞凋亡率显著高于pUC-NC+NC mimic组(P<0.05),而pUC-MYT1L+miR-141-3p mimic组细胞凋亡率显著低于pUC-MYT1L+NC mimic组(P<0.05,见图4c)。

图4 在HCT8细胞系中miR-141-3p的上调,通过MYT1L使细胞表型恶化

3 讨论

越来越多的证据表明,miRNA在肿瘤发生发展过程中发挥关键作用。在癌症中发现了异常的miRNA表达,因此,这些miRNA可能被用来预测预后。miR-141-3p参与了不同组织来源的恶性肿瘤的发生和进展。例如miR-141-3p通过靶向Keap1-Nrf2通路促进卵巢癌的增殖、迁移等恶性生物学行为[8]。miR-141-3p通过ALKBH5介导的PRMT6的m6A修饰促进前列腺癌的恶性进展[9]。在本研究中,我们通过生物信息学方法发现miR-141-3p在结肠癌组织中高表达,并通过qRT-PCR在细胞系中进行验证,检测发现人结肠癌细胞系中miR-141-3p的表达量显著高于正常人结肠上皮细胞系。结合已有的研究报道,我们猜测miR-141-3p在结肠癌中可作为促癌因子。我们将miR-141-3p mimic转染至结肠癌细胞中,进行细胞功能学实验,结果显示miR-141-3p的上调可以促进结肠癌细胞的增殖,迁移并抑制细胞凋亡。说明miR-141-3p在体外结肠癌细胞中有促进细胞表型恶化的作用。

目前对于miR-141-3p 的研究报道显示,其可以通过作用于多个靶基因发挥肿瘤调控作用,如SUSD2[10]、AK2[11]和NME1[12]等。我们利用多个靶向预测网站发现miR-141-3p与MYT1L的3’-UTR靶向结合,并利用双荧光素酶实验验证了两者的靶向结合关系。MYT1L可以将成纤维细胞重编程为神经元,MYT1L的调控机制与它的锌指结构有关,可能是通过MYT1L与DNA特殊位点结合发挥生物学活性[13]。研究表明在人类成胶质细胞瘤细胞系中MYT1L的表达降低,MYT1L的表达上调会抑制成胶质细胞瘤细胞系的增殖,激活与神经元分化相关的基因表达程序,并限制细胞迁移和上皮间充质转化基因集的表达[14]。所以我们推测miR-141-3p很可能通过靶向下调MYT1L的表达来调控结肠癌的发生和发展。因此,我们比较只转染了pUC-MYT1L和转染了pUC-MYT1L和miR-141-3 mimic两组的细胞表型,结果可以得出miR-141-3p表达的上调抑制了MYT1L的表达,并且抑制了MYT1L对结肠癌细胞的增殖和迁移的下调作用。表明miR-141-3p可以靶向下调MYT1L的表达,从而促进结肠癌细胞的发生发展。

综上所述,本研究确定了miR-141-3p对MYT1L在结肠癌细胞中的靶向调控作用。今后的研究中会探究MYT1L与信号通路之间的作用,并在其他结肠癌细胞系中进行研究。本研究可能为结肠癌的发生和发展过程的作用机制提供了一条新的见解,望能对其诊断、治疗提供新的思路。本研究的不足之处为仅以结肠癌细胞株为研究对象,通过体外实验对分子机制进行研究,后续还有待利用动物实验等进行进一步验证和完善。