微小核糖核酸-155 对肝癌细胞增殖、侵袭迁移和凋亡的影响

秦焕蓉，吴祥锴，江哲宇，张 赟，林丽云，王黎洲，周 石

在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）进展过程中有多种基因改变，其中微小核糖核酸（miRNA）参与细胞分化、代谢和发育等各种生物过程，在肿瘤组织中异常表达，与肿瘤发生密切相关［1-5］。研究发现，乳腺癌患者miR-155 水平升高有利于抗肿瘤免疫特征且与更好的预后相关［6］；而宫颈癌患者miR-155 水平升高与不良预后相关［7］。miR-155 在肝癌中表达上调，通过PI3K-AKT 通路抑制磷酸酶和紧张素同源物（PTEN）进而促进肝癌的进展［8］。然而miR-155 是否存在其他下游靶点影响肝癌的进展仍不清楚。本研究通过构建miR-155 沉默稳转株以探讨miR-155 对肝癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡影响的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

用含10%FBS，1%青、 链霉素的完全培养基培养Huh7 人肝癌细胞（中国科学院细胞库），当细胞融合度达到85%以上时进行传代培养，3 次传代后待细胞状态稳定后进行检测。

1.2 稳转株构建

取对数增长期的Huh7 肝癌细胞1×105个接种于6 孔板，待细胞生长至30%～40%，根据慢病毒说明书中推荐的复感染指数=5，换算最佳接种病毒滴度进行转染操作，分别转染shNC、sh-miR-155慢病毒，转染16 h 后进行细胞换液。待细胞长至85%左右将细胞传代至T25 培养瓶，3～4 d 基因表达稳定后，将细胞用胰酶消化离心传代，细胞贴壁后用含2 μg/mL 嘌呤霉素的完全培养基进行稳转细胞株的筛选，反复药筛。待无细胞死亡时，实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测病毒转染效果，转染成功后传代冻存10 管稳转株，以备后续实验使用，在此过程中用含1 μg/mL 嘌呤霉素的完全培养基维持。阴性对照组为转染空载病毒细胞（shNC），转染抑制基因病毒（sh-miR-155）为沉默组。

1.3 RT-qPCR

将Blank、shNC、sh-miR-155 三组细胞分别取2×104个接种于6 孔板，待细胞长至90%左右，采用RNA 快速提取试剂盒（上海奕杉生物科技有限公司）分别提取各组RNA，反转录试剂盒（日本TaKaRa）将RNA 反转录为cDNA，RT-qPCR 得到各组Ct 值。U6 作为内参，根据公式：①ΔCt=各组Ct1（miR-155）-Ct2（U6）；②ΔΔCt=各组ΔCt 值-Blank 组的ΔCt 均值；③miR-155 表达=2-ΔΔCt；④miR-155 相对表达=各组2-ΔΔCt/Blank 组2-ΔΔCt。

1.4 MTT 实验

将Blank、shNC、sh- miR- 155、sh- miR- 155+Recilisib、shNC+Recilisib 等5 组细胞分别用胰酶消化后用完全培养基重悬，调整细胞数量为1×104个/mL。以每孔100 μL 接种于96 孔板，每组设置三个复孔，待细胞贴壁生长后，每孔加入MTT 溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT）10 μL ，继续培养4 h，加入结晶紫溶液，放入酶标仪A490 nm 和A630 nm 处测量各孔的吸光度值。按照公式计算细胞增殖率=［A experimental group（630 nm-490 nm）/A blank group（630 nm-490 nm）］ × 100%。

1.5 Transwell 实验

①迁移： 取各组对数生长期细胞，将细胞消化、离心后，细胞计数，每室铺2×104个细胞，向小室下室加入含20%FBS 的高糖培养基，再轻轻向小室上室加入细胞悬液，避免出现气泡，将培养板置于培养箱48 h 后收样，上室细胞用棉签擦拭，接着使用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，用水清洗后晾干，使用倒置显微镜于200 倍视野下拍5 个视野。②侵袭：提前将枪头和小室放入-20°冰箱预冷，向小室上室加入基质胶使其均匀地铺在小室，第2 天提前半小时将小室置于无血清的培养基中水化，取各组对数生长期细胞，按每室铺5×104个细胞计算细胞悬液量，接着向小室下室加入含20%FBS 培养基。然后将小室置于24 孔板内，每孔加入无血清细胞悬液到小室上室中，细胞生长48 h 后，弃去培养基，用棉签轻轻擦拭干净上室中的基质胶，下室加入1 mL 多聚甲醛固定约30 min，然后用0.1%结晶紫浸泡20 min，PBS 涮洗3 遍，晾干后将24 孔板置于200 倍显微镜下选取5 个视野拍照并计数。

1.6 流式细胞术

将各组细胞消化、离心后，计数并调整细胞为2×105个/mL，培养体系为2 mL 接种于6 孔板，培养箱培养24 h，离心收取细胞沉淀，按照试剂盒说明书依次加入Annexin V-APC/PI 结合液，Annexin V-APC 和PI 染液混匀，轻轻吹打重悬细胞，室温孵育10～15 min，加入预冷PBS 混匀，上机检测各组细胞凋亡情况。

1.7 双荧光素酶实验

为了检测PTPN21 与miR-155 结合，取对数生长期293T 细胞，将其随机分为转染miR-155模拟物组（mimicNC 组）和转染miR-155 抑制剂组（miR-155-3p mimic 组），细胞计数，计算细胞密度为5×104个/mL 所需细胞悬液量，分别接种至48 孔细胞培养板，每个浓度梯度3 个复孔。制备转染复合物，转染后48 h，收集细胞检测各组荧光素酶活性，取样品20 μL，加入100 μL 荧光素酶检测试剂测得相对光单位1（RLU1），完成后，加入100 μL 海肾荧光素酶检测试剂测得相对光单位2（RLU2）。目的基因的激活程度=RLU1/RLU2。

1.8 蛋白质印迹实验

胰酶消化细胞获得细胞沉淀，向Western 及IP裂解液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（Western 及IP 裂解液∶酶抑制剂=100∶1）。在冰上充分裂解30 min，每5 min 震荡1 次，超声破碎后通过高速离心机（12 000 r，15 min）获得蛋白上清液，并使用BCA 试剂盒（索莱宝）配合酶标仪在562 nm 波长条件下测量细胞的蛋白浓度。在60 V（30 min）和110 V （1 h）下，采用一步法聚丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒（10%）（上海雅酶生物医药科技有限公司）凝胶电泳分离蛋白。电泳后，在4℃冷室中用湿电转移法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（德国Amersham 公司）上。然后，将PVDF 膜用5%脱脂牛奶密封，室温孵育2 h，一抗在4℃孵育过夜。次日用含0.1%Tween-20 的Tris 缓冲盐溶液（TBST）洗涤3 次，加入羊抗兔IgG 二抗，室温孵育2 h，再次用TBST 洗涤3 次，将膜用ECL 曝光液浸泡在暗盒里孵育30 s左右放入凝胶成像系统中，最后再将条带导入Image J 软件进行各组蛋白表达水平灰度分析。

1.9 统计学分析

采用SPSS 26.0 统计软件分析实验数据。正态分布的计量资料以表示，多组资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。折线图及柱状图通过GraphPad 8.0 软件制作。

2 结果

2.1 shNC 和sh-miR-155 转染Huh7 人肝癌细胞

RT-qPCR 检验转染效果，sh-miR-155 组中miR-155 的表达水平显著低于Blank 组及shNC 组（P＜0.000 1），miR-155 在Blank 组及shNC 组表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 转染shNC、sh-miR-155 后荧光图及其转染效率

2.2 miR-155 靶向调控PTPN21 的表达

根据microRNA 靶基因预测在线数据库（http：//www.targetscan.org/vert_70/）（http：//mirwalk.umm.uniheidelberg.de/）和（http：//mirdb.org/miRDB/）预测PTPN21 基因3' 非翻译区（PTPN21-3'-UTR）上存在与miR-155 的潜在靶向结合点。双荧光素酶实验结果显示，miR-155-3p 与PTPN21 有2 个结合位点，2 个位点分别设计PTPN21- 3'UTR 突变序列（PTPN21-3'UTR MUT-1）和（PTPN21-3'UTR MUT-2）。miR-155-3p 可以和PTPN21-3'UTR 野生型（PTPN21-3'UTR WT）结合使双荧光素酶活性增强，MUT-1 位点突变后双荧光素酶的活性也增强，说明该位点不是结合位点； 而MUT-2 位点突变后双荧光素酶活性没有变化，说明该位点是结合位点。通过双荧光素酶实验得出：miR-155-3p 可与PTPN21 结合，且结合位点是MUT-2 对应的序列，见图2。

图2 双荧光素酶实验检测miR-155 与PTPN21 的关系

2.3 沉默miR-155 抑制肝癌细胞的增殖

MTT 结果显示，sh-miR-155 组中Huh7 细胞在2、3、4、5 d 时A 值均低于Blank 组及shNC 组（P＜0.000 1），而Blank 组与shNC 组差异无统计学意义（P＞0.05）；sh-miR-155 组在2、3、4、5 d 时A 值低于sh-miR-155+Recilisib 组及shNC+Recilisib 组（P=0.005 2，P＜0.000 1），而sh-miR-155+Recilisib 在2、3、4、5 d 时A 值低于shNC+Recilisib 组（P＜0.000 1），见图3。

图3 MTT 检测各组细胞增殖能力（**** 与Blank 组相比，P＜0.000 1）

2.4 沉默miR-155 抑制肝癌细胞的迁移和侵袭

Blank 组与shNC 组迁移及侵袭细胞数差异无统计学意义（P＞0.05），在激活PI3K-AKT 信号通路后，与Blank 组相比，shNC+Recilisib 组肝癌细胞的迁移、侵袭能力显著增加（P＜0.000 1）。相反，沉默miR-155 后Huh7 细胞的迁移及侵袭细胞数明显低于Blank 组及shNC 组（P＜0.000 1），而PI3K 激动剂逆转了这一现象，与sh-miR-155 组相比，sh-miR-155+Recilisib 组肝癌细胞的迁移、 侵袭能力增强（P=0.000 2），见图4。

图4 Transwell 检测各组细胞侵袭及迁移能力

2.5 敲低miR-155 促进肝癌细胞的凋亡

流式细胞术结果显示，Blank 组、shNC 和shNC+Recilisib 组之间细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。与Blank 组相比，sh-miR-155 组细胞凋亡率显著增加（P＜0.000 1），并且sh-miR-155 组细胞凋亡率高于sh-miR-155+Recilisib 组（P＜0.000 1），见图5。

图5 各组肝癌细胞流式细胞术图及凋亡分析柱状图（与Blank 组相比，ns：P＞0.05；****：P＜0.000 1）

2.6 miR-155 对PTPN21、PI3K-AKT 信号通路及凋亡相关蛋白的影响

蛋白印迹实验结果显示，与Blank 组相比，沉默miR-155 后促凋亡蛋白Caspase-3 和BAX 表达水平显著增加（P＜0.000 1），而抗凋亡蛋白BCL2 的表达量明显降低（P＜0.000 1）； 此外，sh-miR-155 组与Blank 组相比PTPN21 表达明显下调（P＜0.000 1），而在PI3K-AKT 信号通路激活时PTPN21 表达较shmiR-155 组高（P＜0.000 1），但sh-miR-155+Recilisib组PTPN21 表达仍低于Blank 组（P=0.000 2）；与Blank组相比，在沉默miR-155 后P-AKT 和P-PI3K 的表达显著下降（P＜0.000 1），且sh-miR-155+Recilisib 组P-AKT 和P-PI3K 表达也较Blank 组低（P=0.017 7，P=0.031 3），而sh-miR-155+Recilisib 组P-AKT和P-PI3K 表达较sh-miR-155 组高（P＜0.000 1，P=0.001 4），PI3K 与AKT 在各组肝癌细胞之间的差异无统计学意义（P＞0.05），见图6。

图6 蛋白质印迹检测PTPN21、PI3K-AKT 信号通路及凋亡相关蛋白

3 讨论

研究表明，miRNA 与肿瘤的发生有密切关系，致癌相关miRNA 的过表达通过沉默肿瘤抑制因子或参与细胞分化中的某一过程，最终影响肿瘤组织血管生成、增殖及侵袭水平导致肿瘤形成［9-11］。miR-155 作为一类癌症相关miRNA，在各种肿瘤细胞中表达量增加，如胃癌、膀胱癌、结直肠癌、乳腺癌和其他实性恶性肿瘤，并发挥不同的作用［12］。此外，miR-155 在肝癌中高表达，并与HCC 患者不良的临床病理特征和较低生存率相关［13］。本研究通过构建miR-155 沉默稳转株，探讨下调miR-155 后对肝癌细胞增殖和侵袭迁移影响的机制。

PTPN21 在肺癌［14］、膀胱肿瘤［15］及非霍奇金淋巴瘤［16］中高表达，同时参与肿瘤细胞的生长过程，但其在肝癌中的作用机制尚不明确。本研究发现，PTPN21 基因3'-UTR 上存在与miR-155 相结合的潜在靶点。双荧光素酶实验结果显示，miR-155-3p与PTPN21 有2 个结合位点，2 个位点分别设计突变序列MUT-1 和MUT-2，MUT-1 位点突变后双荧光素酶的活性增强，而MUT-2 位点突变后双荧光素酶活性没有变化，说明MUT-2 是结合位点，并且miR-155 沉默可以抑制PTPN21 的表达，提示PTPN21 是miR-155 的下游靶点。

PI3K-AKT 通路是调控细胞生长、代谢、增殖、存活、转录和蛋白质合成的关键调控中心［17］。研究表明，miRNA 在调控PI3K-AKT 通路中发挥着至关重要的作用，其通过靶向PI3K-AKT 信号轴，在调节细胞增殖、凋亡和代谢方面具有重要意义［18-19］。本研究发现下调miR-155 后，各组PI3K、AKT 总蛋白变化不明显，而磷酸化蛋白P-PI3K、P-AKT 表达量明显下降，提示miR-155 的表达与PI3K-AKT 通路呈正相关。为了进一步验证miR-155 对肝癌细胞生长影响是通过PI3K-AKT 通路实现的，本实验在shNC组及沉默miR-155 的同时应用PI3K-AKT 通路激动剂，观察PI3K-AKT 通路相关蛋白的变化情况，结果显示，与shNC+Recilisib 组相比，miR-155 可抑制P-PI3K 及P-AKT 的表达，提示miR-155 可通过调控PI3K-AKT 通路影响HCC 生长。MTT 实验发现，沉默miR-155 可抑制肝癌细胞的增殖。此外，流式细胞术结果显示，与Blank 组及shNC 组相比，shmiR-155 组细胞凋亡率显著增加，Blank 组和shNC组细胞凋亡量无显著变化，差异无统计学意义。细胞凋亡常与多个信号传导通路密切相关，其中BCL-2及Caspase 家族蛋白扮演着重要角色，当细胞进入凋亡途径时，抑凋亡蛋白BCL-2 表达水平下调，而促凋亡蛋白BAX 表达上调，其下游Caspase 家族蛋白接受凋亡信号，进而激活Caspase-3 活化，执行凋亡程序［20］。本研究结果显示，sh-miR-155 组与Blank组及shNC 组相比，抑凋亡蛋白BCL-2 表达水平显著降低，促凋亡蛋白Caspase-3 及BAX 表达水平显著提高，加速了肝癌细胞凋亡进程。

有研究表明，沉默PTPN21 通过调控PI3K-AKT信号通路抑制胶质瘤的进展［21］。本研究中，Transwell结果显示，沉默miR-155 明显抑制肝癌细胞侵袭及迁移。以上实验表明，miR-155 通过靶向PTPN21 调控PI3K-AKT 信号通路，进而影响肝癌细胞生长，提示miR-155 在肝癌发生发展过程中发挥促癌基因的作用。

综上所述，沉默Huh7 细胞中miR-155 通过靶向PTPN21 调控PI3K-AKT 信号通路抑制肝癌细胞生长。因此，miR-155 可能是未来HCC 患者的辅助诊断指标之一，也为临床治疗HCC 患者提供了新的治疗靶点。