标本溶血对阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者血生化项目检测影响的实验室处理路径研究

艾丽皮热·帕尔哈提 王 琳 苏看看 张炳峰 穆 原 张世昌 张洁心

南京医科大学第一附属医院检验学部，江苏南京 210029

阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一种克隆性造血干细胞疾病[1-4]。该病主要特征有溶血性贫血、骨髓衰竭，血栓形成和外周血细胞减少[5-8]。患者治疗期间需监测肝肾功能、心功能和血糖等，以便准确评估脏器损伤，及时变更用药方案[9-12]。但PNH 患者的血清标本常发生严重溶血。血生化项目易受溶血影响[13-15]。未经溶血校正的检测报告很有可能误导主诊医生判断，造成严重后果。但是目前没有可供实验室参考使用的校正方案。日常工作中部分PNH 患者同时留取的血浆标本并无溶血现象。由此可知，离心操作时红细胞受惰性分离胶挤压而破碎引起不同程度溶血。本研究通过体外实验首先明确受挤压式溶血影响显著的生化项目，再建立血清溶血校正方程和血浆参考区间，达到客观解读检验报告的最终目标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

按美国临床和实验室标准协会文件C28-A3《临床实验室如何制定参考区间》[16]及我国卫生行业标准WS/T 402-2012《临床实验室检验项目参考区间制订》[17]要求，对南京医科大学第一附属医院体检中心2022年11 月至2023 年4 月的体检者进行筛选，包括年龄、生活习惯、工作条件等社会人口基本情况及手术史，用药史，全身疾病史[9]。选取健康体检者共275 名为研究对象。本研究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会审批（2022-SR-505）。

1.2 纳入标准

①年龄18～79 岁；②既往身体健康；③近期未曾大量失血，手术或服用药物；④检验科生化室开展的血生化28 项检测结果均在正常参考范围。

1.3 排除标准

①有阵发性睡眠性血红蛋白尿，血栓形成，骨髓衰竭、泌尿生殖道感染；②有消化系统疾病、呼吸系统疾病、高血压、冠心病、糖尿病、肿瘤等；③有腹痛、静脉血栓、肺动脉高压、吞咽困难、肝脾肿大等临床症状；④贫血、全血细胞计数减少或红系伴粒系或血小板计数减少、外周血出现幼红细胞及嗜多染红细胞、尿潜血实验阳性；⑤酸化溶血试验、蔗糖溶血试验、蛇毒因子溶血试验、补体溶血敏感试验和尿含铁血黄素试验阳性；⑥血管内溶血，流式检测提示血细胞表面糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）锚连蛋白缺陷，铁缺乏，含铁血黄素尿；⑦有营养不良，有素食、酗酒、嗜烟等习惯；⑧处于妊娠期或哺乳期的妇女；⑨检验科生化室开展的血生化28 项中一项及以上检测结果超过正常参考范围。

1.4 血标本采集和检测

①纳入25 名健康体检者。各收集1 份EDTA-K2抗凝管静脉血，3 000 r/min，离心半径22.8 cm，离心10 min 分离红细胞；同时收集2 份黄色促凝管静脉血，3 000 r/min，离心半径22.8 cm，离心10 min 分离血清。PBS 清洗红细胞2 次。各体检者血清重悬自身红细胞，使用头皮针反复吹打致红细胞破碎，得到梯度模拟溶血液。未溶血血清和模拟溶血液分别检测溶血指数及生化28 项，记录结果。②纳入250 名健康体检者。各收集1 份肝素锂抗凝管静脉血和1 份黄色促凝管静脉血。3 000 r/min，离心半径22.8 cm，离心10 min分离肝素锂抗凝管血浆；3 000 r/min，离心半径22.8 cm，离心10 min 分离黄色促凝管血清。分别检测多个血生化项目，记录结果。所有血标本均无溶血、黄疸和脂浊。

1.5 仪器与试剂

总胆红素（total bilirubin，TBil）、直接胆红素（direct bilirubin，DBil）和肌酐（creatinine，CREA）试剂购自上海科华生物工程股份有限公司，批号分别为TBil（20210722）、DBil（20210712）和CREA（20210812）。脂蛋白a 试剂购自日本株式会社岛研究所，批号为UJ22。视黄醇结合蛋白试剂购自南京诺尔曼生物技术有限公司，批号为21112611。腺苷脱氨酶试剂购自浙江东瓯诊断产品有限公司，批号为2021040027。其余试剂购自美国贝克曼库尔特有限公司，批号分别为丙氨酸氨基转移酶（8891）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST；0264）、碱性磷酸酶（9816）、谷氨酰转肽酶（glutamyl transpeptidase，GGT；9725）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH；9735）、肌酸激酶（creatine kinase，CK；9861）、α-羟丁酸脱氢酶（α-hydroxybutyrate dehydrogenase，α-HBDH；9852）、总蛋白（total protein，TP；0008）、白蛋白（9771）、糖（8808）、尿素（urea，UR；0450）、尿酸（9708）、钙（8516）、磷（phosphorus，Phos；9175）、镁（9116）、钾离子（potassium，K+；9043）、钠（9043）、氯（9043）、总胆固醇（total cholesterol，TC；8562）、甘油三酯（0161）、高密度脂蛋白胆固醇（9751）和低密度脂蛋白胆固醇（0385）。使用美国贝克曼库尔特实验系统（苏州）有限公司AU5800全自动生化分析仪检测溶血指数及生化项目，反应参数参照仪器配套的操作说明书设置。

1.6 建立血清溶血校正方程

将每份模拟血溶液按溶血指数分组，即血红蛋白浓度50～99 mg/dl时溶血指数为1+；血红蛋白浓度100～199 mg/dl 时溶血指数为2+；血红蛋白浓度200～299 mg/dl 时溶血指数为3+。分别计算28 项生化项目实测值与原始值间的偏倚，即溶血检测偏倚（hemolysis bias，BH）=（实测值-原始值）/原始值。分别计算每个项目各组BH的均值和标准差。以溶血指数为横坐标，BH均值为纵坐标作图，得到每个项目的血清溶血校正方程。

1.7 建立血浆参考区间

分别计算每个体检者各生化项目血浆检测值与血清检测值的偏倚，即血清检测偏倚（serum bias，BS）=（血浆检测值-血清检测值）/血清检测值。将各生化项目BS均值与2019 年WESTGARD QC（https：//www.westgard.com/biodatabase1.htm）中规定偏倚相比较，确定需建立血浆参考区间的项目。若数据呈高斯正态分布，用（x±1.96 s）表示95%数据分布范围；若是数据不呈高斯正态分布，则单侧采用P5 的下限或P95 的上限，以此确定检验项目的血浆参考区间。

参考区间的变异主要由个体内生物学变异（within-subject variation，CVI）和个体间生物学变异（between-subject variation，CVG）决定，两者共同组成了人群生物学变异。而分析偏倚（analysis bias，BA）的存在会引起人群的错误划分，适当BA应为，最低BA应为[18]。将250 例体检者的血浆、血清标本分别检测上述受挤压式溶血影响较大的11 个生化项目，逐一比较血浆结果与血清结果间的差异，判断是否需要建立血浆参考区间。

1.8 统计学方法

采用四分位间距法剔除均值±1.5 倍四分位间距之外的离群数值。采用假设检验方法分析数据分布情况。采用Microsoft Excel 软件录入数据和绘制趋势线。

2 结果

2.1 成功建立8 个项目的血清溶血校正方程

按溶血指数将模拟溶血液分成三组，分别是溶血指数1+组含26 份模拟溶血液，溶血指数2+组含41份模拟溶血液和溶血指数3+组含30 份模拟溶血液。将上述各模拟溶血液进行28 个生化项目检测，计算得到每个项目各组BH的均值和标准差。其中，AST、GGT、LDH、CK、α-HBDH、TC、TP、UR、CREA、Phos 和K+共11 个项目受溶血影响较大，见表1。其中8个项目可建立溶血校正方程，所得R2均＞0.90。见图1。

图1 8 个生化项目的血清溶血校正方程及特征参数

表1 11 个血生化项目的BH 均值和标准差（n=30）

2.2 成功建立5 个项目的血浆参考区间

经统计分析，剔除离群40例，纳入210 例，其中男110 例，女100 例，男性年龄17～73 岁，女性年龄16～79 岁。AST 项目的BS超过规定适当BA，LDH、TP、Phos 和K+4 个项目的BS超过规定最低BA，因此需建立这5 个生化项目的血浆参考区间。5个项目的血浆检测结果均符合正态分布，根据x±1.96 s 可得对应血浆参考区间。AST 血浆参考区间为（21.9±10.5）U/L，LDH为（166±58）U/L，TP 为（71.3±10.8）g/L，Phos 为（1.14±0.37）mmol/L，K+为（3.66±0.61）mmol/L。见表2。

表2 5 个血生化项目的规定BA 和BS 的比较（%）

3 讨论

PNH 患者X 染色体上的磷脂酰肌醇聚糖-A 类基因发生突变，使其血细胞表面的两种GPI 锚连蛋白CD55 和CD59 缺失，导致血细胞破坏溶解[19-25]。处于PNH 发病期患者的血生化项目如AST、LDH 和α-HBDH 的检测结果常远高于参考区间上限。更值得注意的是，患者血清K+多为危急值（＞6 mmol/L）。但部分患者表示仅有体力欠佳和运动后心慌表现。因此，发生溶血的血清生化检测结果与患者实际情况不符，不具有临床参考意义。对于受挤压式溶血影响较大血生化项目的检测，本研究通过建立血清溶血校正方程和血浆参考区间，向临床提供两种实验室处理路径：①优先使用肝素锂抗凝管留取患者血标本进行血浆生化项目检测；②对于已发生溶血的血清标本，使用血清溶血校正方程进行处理。本研究结果填补了PNH血生化项目检测方面的空白，为PNH 检验流程进一步优化提供必要依据，服务临床，造福患者。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。