七种不同基质金属蛋白酶在抗结核药物性肝损伤小鼠模型中的表达与临床价值

陆霓虹 杜映荣 刘洪璐 陈杨君 杨永锐

昆明市第三人民医院云南省传染性疾病临床医学中心，云南昆明 650041

抗结核药物性肝损伤（anti-tuberculosis druginduced liver injury，ATB-DILI）发病率较高，影响抗结核治疗效果[1-4]。因为ATB-DILI 致病因素复杂，缺乏有效防治措施及方法[5]。肺结核患者在治疗过程中常出现保肝药物的滥用和不必要联用，如何早期识别肝损伤是疾病防控重点。此外，临床缺乏肝功能预后的预测指标，发现早期预测肝损伤程度及预后的指标具有重要意义。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）与多种炎症进程相关，不同亚型的MMP（MMP-2、9、14等）在炎症环境下促进细胞自噬，导致肝细胞的损伤和死亡，但罕见MMP 在ATB-DILI 中的相关报道[6]。团队前期发现ATB-DILI 患者血清MMP-9、14 表达上调[7-8]。本研究通过分析ATB-DILI 动物模型中MMP 的表达变化，发现影响ATB-DILI 的因素，为探究ATB-DILI预测指标奠定动物模型基础。

1 对象与方法

1.1 实验动物

120 只雄性昆明种（KM）小鼠，SPF 级，6 周龄，体重18～24 g，由中国科学院昆明动物所实验动物中心提供，合格证号：YNXY（滇）-2019-22，生产许可证号：SCKK（粤）2020-0053。小鼠饲养于中国科学院昆明动物所实验动物中心屏障系统，合格证号：（昆）-2019-103。饲养条件一致，室温21～26 ℃，湿度55%～65%，明暗各12 h。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 SPECTCA MAX190 酶标仪（美国Molecular Devices 公司）、4 ℃/-20 ℃电冰箱（青岛海尔国际贸易有限公司）、ST8R 高速冷冻离心机（美国Thermo Scientific 公司）等。

1.2.2 使用药物 成都锦华药业有限公司异烟肼片（isoniazid，INH，0.1 g/片，批号：230815）、利福平胶囊（rifampicin，RIF，0.15 g/粒，批号：J2523011）、盐酸乙胺丁醇片（ethambutol hydrochloride，EB，0.25 g/片，批号：T23N003）、吡嗪酰胺片（pyrazinamide，PZA，0.25 g/片，批号：23070）。根据动物与人体重剂量折算系数，得出小鼠药物给药剂量[9]。INH 45 mg/（kg·d）、RIF 90 mg/（kg·d）、EB 135 mg/（kg·d），吡嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）180 mg/（kg·d）。用0.5%羧甲基纤维素配成所需浓度的混悬液备用。

1.2.3 实验试剂 MMP-1、2、3、7、9、13、14 酶联免疫吸附试验法试剂盒（货号：KE10033、34、35、36、37、38、39），购自美国Proteintech 公司。牛分枝杆菌减毒株卡介苗（BacillusCalmette-Guérin，BCG，试剂号：S20123007，成都生物制品研究所）。

1.3 实验分组及处理

120 只小鼠适应性喂养1 周后随机选100 只BCG 滴鼻，1 周后取肺组织采用PCR 检测BCG、菌落培养证实感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB），建立感染MTB 的小鼠模型。将小鼠随机区组法分为5 组，每组20 只，各组体重均衡。①INH组灌胃INH 45 mg/（kg·d）；②RIF 组，灌胃RIF 90 mg/（kg·d）；③EB 组，灌胃EB 135 mg/（kg·d）；④PZA 组，灌胃PZA 180 mg/（kg·d）；⑤四联药物组，灌胃四联混合药（INH 45 mg+RIF 90 mg+EB 135 mg+PZA 180 mg）/（kg·d）。另外20 只未感染MTB 的小鼠设为对照组，灌胃PBS。所有小鼠每天空腹灌胃1 次，各组分别于灌胃12 h，1、2、3 周后处死5 只小鼠。处死前称重，断头取血，肝脏病理切片出现肝损伤，证实建模成功[10]。本研究经昆明市第三人民医院伦理委员会审批同意（201902312）。

1.4 观察指标及检测方法

EDTA 抗凝小鼠血，离心机4 ℃，3 500 r/min，离心20 min，离心半径16.80 cm，取上清置于-20℃保存。按照试剂盒说明操作，酶联免疫吸附试验法检测MMP-1、2、3、7、9、13、14 表达。小鼠肝称湿重，肝脏指数=肝脏湿质量（g）/小鼠体质量（g）×100%[11]。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，比较采用SNK-q 检验，相关分析用Pearson 检验。不符合正态分布的计量资料采用中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，比较采用Kruskal-Wallis H 秩和检验，总体差异用Kruskal-Wallis 单因素ANOVA（k 样本）检验，相关分析用Spearman 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗结核药对小鼠的一般状况影响

对照组小鼠体重逐步增加，活动正常。给药小鼠精神萎靡，不愿活动。随给药时间延长，小鼠皮毛颜色暗淡，活动少，进食少，体重增加较正常对照组少。见图1。

图1 灌胃不同药物3 周小鼠体重变化（n=20）

2.2 各组给药12 h 小鼠血清MMP-1、2、3、7、9、13、14表达水平及肝脏指数比较

给药12 h，与对照组比较，RIF 组MMP-7 表达上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组MMP-1、2、3、9、13、14 表达和肝脏指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组给药12 h 小鼠血清MMP-1、2、3、7、9、13、14 表达水平及肝脏指数比较（n=5）

2.3 各组连续灌胃1 周小鼠血清MMP-1、2、3、7、9、13、14 表达水平及肝脏指数比较

连续灌胃1 周，与对照组比较，INH、RIF 和四联药组小鼠MMP-2 和MMP-7 表达上调，肝脏指数升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组MMP-1、3、9、13、14 表达和肝脏指数与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组连续灌胃1 周小鼠血清MMP-1、2、3、7、9、13、14 表达水平及肝脏指数比较（n=5）

2.4 各组连续灌胃2、3 周小鼠血清MMP-1、2、3、7、9、13、14 表达水平及肝脏指数比较

连续灌胃药物2、3 周后，与对照组比较，RIF、INH、四联药组小鼠血清MMP-2、7、9 表达上调，肝脏指数升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组其他MMP 表达水平和肝脏指数与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组连续灌胃2、3 周小鼠血清MMP-1、2、3、7、9、13、14 表达水平及肝脏指数比较（n=5）

2.4 不同抗结核药致肝损伤小鼠中MMP-2、7、9 与肝脏指数的相关性分析

INH 组MMP-2、7、9 与肝脏指数无相关性（r=0.233、0.241、0.215，P＞0.05），四联药组MMP-2、7、9与肝脏指数无相关性（r=0.242、0.252、0.273，P＞0.05）。RIF 组MMP-7 与肝脏指数呈正相关（r=0.981，P＜0.05）。

3 讨论

ATB-DILI 的发生机制尚无定论，多种因素如免疫反应、炎症反应等证实与ATB-DILI 相关，但ATB-DILI 是否与MMP 家族介导的炎症反应相关，尚无研究报道[12-15]。MMP 是一类广泛存在于各种组织中的蛋白酶超家族，在细胞外基质的生理性和病理性降解中发挥重要作用[16]。MMP 主要分为胶原酶、基质溶解素、明胶酶等亚家族[17]。许多组织和细胞均可产生MMP，巨噬细胞和中性粒细胞产生MMP-2、9 作用于血管平滑肌细胞，MMP-3、7 作用于上皮细胞，促进多种炎症因子的分泌[18]。

本研究显示，INH、RIF 与四联抗结核药组小鼠MMP-2、7、9 在灌胃1～3 周后逐步升高，提示MMP-2、7、9 与抗结核药INH、RIF 导致的肝损伤具有相关性，ATB-DILI 可能为一种炎症反应，并与MMP 有关。EB组、PZA 组MMP-1、2、7、9、13、14 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示MMP-2、7、9介导的炎症反应主要与INH、RIF 有关，与EB 与PZA两种药物相关性不大。

MMP-7 是MMP 家族中最小的分子，主要由巨噬细胞及肿瘤细胞分泌，与肿瘤形成、肝纤维化与炎症坏死密切相关[19]。本研究显示MMP-7 在INH、RIF 与四联抗结核药导致的肝损伤中持续性升高，提示MMP-7 介导的炎症反应是ATB-DILI 发生的重要因素。MMP-7 能协同各类炎症因子促进上皮细胞基质降解，细胞坏死溶解[20]。在炎症状态下MMP-7 还能直接促进成纤维细胞及血管内皮细胞增殖活性，增加MMP-2、9 表达，促进血管增生及肝组织纤维化[21-22]。本研究显示，肝损伤发生时巨噬细胞增生活跃，MMP-7表达上升，从而促进MMP-2、9 分泌增加，肝损伤加重。这也解释了动物实验中MMP-7 上升1 周后，MMP-2、9随后逐步上升，验证了MMP-7 与MMP-2、9 有协同作用，与文献报道吻合[23]。

综上，MMP-2、7、9 介导的炎症反应与抗结核药物性肝损伤密切相关，其中MMP-7 可用于预判抗结核药物性肝损伤严重程度。通过进一步研究MMP-2、7、9 的上游通路，发现下游因子并进行阻断，可能对防治ATB-DILI 具有一定临床价值。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。