槐米药材、饮片、标准汤剂与配方颗粒的HPLC特征图谱相关性研究及量值传递分析

任晶，刘俊潼，鄢必新，白冰，展月，张庆贺*，陈长宝*（.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，长春 307；.吉林修正药业新药开发有限公司，长春 3003）

槐米为豆科植物槐（SophorajaponciaL.）的干燥花蕾，其性微寒，味苦，具有凉血止血、清肝泻火的功效，可用于便血、痔血、血痢、崩漏、衄血、肝热目赤、头痛眩晕等症状的治疗[1]。槐米含有黄酮、皂苷、甾醇等成分，主要活性成分为芦丁、槲皮素等黄酮类化合物[2]，其有效成分具有抗癌防癌、镇痛、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等多种活性，能够改善心肌循环、清热解毒、降血脂、软化血管。我国是中药槐米的原产地，在全国多地均有种植，资源丰富[3]。槐米配方颗粒是以槐米药材为原料，经水提、浓缩、干燥、制粒而成，经中医临床配方后，供患者即冲即服的颗粒[4-5]。配方颗粒与药材之间的药效存在着较强的关联性，目前对槐米的质量评价大多还着重于芦丁的含量测定，如果仅用某成分的含量限度作为质量控制指标，较难全面地说明配方颗粒的整体质量。目前有槐米药材的指纹图谱研究相关报道，但尚无对槐米及其制剂产品之间的相关性研究，更缺乏槐米药材-饮片-标准汤剂-配方颗粒特征图谱之间的相关性研究。为保证槐米配方颗粒安全、有效、质量可控，本研究建立了槐米药材-饮片-标准汤剂-配方颗粒的HPLC特征图谱，对其相关性进行评价，并考察量值传递规律，不仅能全面控制配方颗粒的质量，而且能反映配方颗粒制备工艺的稳定性，为槐米配方颗粒制备全过程的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

戴安U3000高效液相色谱仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；MS105DU型电子天平、TOLEDO XPR2型百万分之一分析天平（梅特勒-托利多公司）；SB25-12DT型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 材料

水仙苷（批号：111997-201501，纯度：93.1%）、芦丁（批号：100080-202012，纯度：91.6%）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（批号：112007-201602，纯度：90.8%）、异鼠李素（批号：110860-202012，纯度：99.1%）、异槲皮苷（批号：111809-202205，纯度：96.3%）、槲皮素（批号：100081-201610，纯度：99.1%）（中国食品药品检定研究院）；乙腈为色谱纯（默克股份有限公司）；乙醇、甲醇、磷酸（分析纯，北京化工厂）；其他试剂均为分析纯。在全国范围内共收集样品15批，经长春中医药大学陈长宝教授鉴定为豆科植物槐（SophorajaponciaL.）的干燥花蕾，由修正药业配方颗粒工艺研究室制成同批号饮片、标准汤剂、配方颗粒，批号及药材具体来源见表1。

表1 样品信息Tab 1 Sample information

2 方法与结果

2.1 槐米药材、饮片、标准汤剂与配方颗粒的HPLC 特征图谱

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，17%～20%A；15～25 min，20%～25%A；25～35 min，25%～35%A；35～50 min，35%～45%A）；流速1.0 mL·min-1；柱温30℃；检测波长257 nm；进样量5 μL。

2.1.2 参照物溶液制备 取槐米对照药材0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率25 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取芦丁、水仙苷对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作为对照品参照物溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》，制备槐米的标准汤剂（每克标准汤剂相当于3.0 g 饮片），编号 C1～C15，具体方法如下：取槐米饮片100 g，精密称定，加10倍量水浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸30 min，趁热滤过；药渣加8倍水煎煮，武火煮沸，文火保持微沸 30 min，趁热滤过，合并两次煎液，减压浓缩，冷冻干燥得标准汤剂粉末。

称取槐米药材、饮片粉末（均过四号筛）约0.1 g，标准汤剂、配方颗粒粉末（研细）约0.03 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率25 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 测定 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录50 min色谱图，见图1～2。

图1 对照特征图谱（R）及槐米药材（A）、饮片（B）、标准汤剂（C）、配方颗粒（D）HPLC特征图谱Fig 1 Reference characteristic chromatogram（R），and HPLC characteristic chromatogram of raw herbs（A），pieces（B），standard（C），and formula granules（D）of 15 batches of FSI

图2 槐米药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC对照特征图谱Fig 2 HPLC characteristic chromatogram of SFI raw herbs，decoction pieces，standard decoction，and formula granules

2.2 方法学考察

2.2.1 专属性试验 分别取空白溶液、对照品溶液及供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，结果如图3所示，供试品溶液色谱在与各对照品溶液色谱相应的保留时间处具有相同的色谱峰，指认了芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、槲皮素、异鼠李素6种成分，且空白溶剂无干扰，表明该方法专属性良好。

图3 专属性试验HPLC色谱图Fig 3 HPLC chromatograms of specific test

2.2.2 精密度试验 取同一供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次，分别对特征峰的相对保留时间及相对峰面积进行计算，结果显示各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD范围分别为0.05%～0.11%和0.15%～2.5%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重现性试验 取供试品，按“2.1.3”项下方法分别制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，分别对特征峰的相对保留时间及相对峰面积进行考察，结果各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD范围分别为0.04%～0.15%和0.12%～2.8%，表明本方法重现性良好。

2.2.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、18、24 h进样测定。结果显示各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD范围分别为0.02%～0.12%和0.17%～2.1%，表明供试品溶液在24 h内较稳定。

2.3 共有峰的标定

将槐米配方颗粒的HPLC特征图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”（2012版）对色谱图进行匹配，经比较分析后确定7个共有峰，同法采集药材、饮片、标准汤剂的特征图谱，发现药材、饮片、标准汤剂均有7个共有峰，与对照特征图谱相似度均达到了0.90以上[6-7]，见表3。选择峰5（水仙苷）为参照峰，因为芦丁峰面积较大，超过总峰面积的50%，不适宜作为参照峰来计算其他峰的相对峰面积比，5号峰峰面积适中，所以选择5号峰作为参照峰。

表3 15批槐米药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的相似度Tab 3 Similarity of the characteristic chromatograms of 15 batches of SFI raw herbs，decoction pieces，standard decoction，and formula granules

2.4 相关性分析

从整体上看，槐米药材、饮片、标准汤剂及配方颗粒HPLC特征图谱的1～7号峰是共有峰。结果显示，15批次槐米药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱相似度分别在0.931～1.000，说明槐米药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒相似度极高，能够较好地保留药材的特征性成分，具有整体物质的一致性，其化学成分相关性较好[8]。饮片经过现代化提取、浓缩等工艺制成配方颗粒后主要化学成分组成基本相同，制得的槐米配方颗粒与传统标准汤剂具有一定的等效性，表明槐米配方颗粒的制备工艺稳定、可行[9]。

2.5 含量测定及量值传递分析

2.5.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相为甲醇-1%冰醋酸溶液（32∶68）；检测波长257 nm；流速1 mL·min-1；柱温30℃；进样量10 µL。理论塔板数按芦丁峰计算应不低于2000。

2.5.2 溶液的制备 取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液，即得。供试品溶液制备方法同“2.1.3”项下。

2.5.3 指标成分的含量及转移率的测定 精密吸取各供试品溶液10 µL，按“2.5.1”项下方法对15批槐米药材、饮片、提取物膏粉、配方颗粒、标准汤剂进行含量测定[10]，按照以下公式计算芦丁转移率：槐米药材-饮片转移率（%）＝槐米饮片中指标成分的含量/槐米药材中指标成分的含量×100%；槐米饮片-提取物膏粉转移率（%）＝槐米提取物膏粉中指标成分的含量×出膏率/槐米饮片中指标成分的含量；槐米饮片-配方颗粒转移率（%）＝槐米配方颗粒中指标成分的含量×出膏率/槐米饮片中指标成分的含量/干膏粉占比；槐米饮片-标准汤剂转移率（%）＝槐米标准汤剂中指标成分的含量×出膏率/槐米饮片中指标成分的含量；出膏率（%）＝干膏重/饮片质量×100%。结果见表4。

表4 15批样品含量及转移率测定结果Tab 4 Determination of content and transfer rate of 15 batches of samples

2.5.4 量值传递分析 标准汤剂是配方颗粒中间体和成品标准的关键参照物，本研究得到的15批槐米饮片到标准汤剂转移率范围为43.43%～59.00%，均值为51.19%；出膏率范围为28.57%～34.21%，均值为32.07%；指标成分含量范围为26.30%～35.34%，均值为31.11%；对槐米配方颗粒生产过程中各关键环节样品进行含量测定，结果表明各环节转移率、出膏率及指标性成分含量均在标准汤剂范围内，量值传递较好[11]。本研究中饮片-配方颗粒芦丁转移率略低于同批次饮片-标准汤剂转移率，可能由于标准汤剂制备为冷冻干燥，未添加辅料；配方颗粒在生产过程中为喷雾干燥，制备过程中增添少量辅料，生产过程中出现指标成分损失，造成转移率略低。

3 讨论

本研究在对特征图谱方法建立过程中，分别采用甲醇、70%甲醇、乙醇不同提取溶剂及热回流、超声不同提取方法进行考察，从提取的全面性、稳定性、操作便捷性等方面进行考察，最终选择槐米提取溶剂为甲醇，提取方法为超声提取法，提取时间为0.5 h。分别考察不同检测波长，结果表明在257 nm时各成分色谱行为较好，综合考虑其出峰数量、峰形、响应值等情况，选定检测波长为257 nm；考察柱温为25、30、35℃的色谱图，结合色谱峰分离度、对称性及实际室内温，选定柱温为30℃[12]。分别考察了乙腈-0.1冰醋酸、乙腈-0.05%、乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，并对上述洗脱条件进行调整，结果表明以乙腈-0.1%磷酸水为流动相进行梯度洗脱，色谱峰分离效果较好，峰形较好[13]。

配方颗粒作为中药饮片改革的新趋势，具有免煎煮、便于调配及携带、使用灵活、用药精准等优点。经制剂工艺加工而成的中药配方颗粒已失去了饮片所具有的外观辨别特征，在显微结构下也不易鉴别，并且以单一成分衡量质量标准很难反映配方颗粒的整体特征，特征图谱能最大限度获取配方颗粒、标准汤剂、饮片及药材之间的化学信息，高效地将中药配方颗粒的内在信息反馈在图谱中，直观观察和评价内在质量[14]。本研究中，槐米药材-饮片-标准汤剂及配方颗粒的对照图谱的主要峰基本一致，主要化学成分组成基本相同，建立的 HPLC 特征图谱确定了7个共有峰，并指认了6个色谱峰，该分析方法简便、稳定、重现性好，能较全面地反映槐米药材、饮片、标准汤剂及配方颗粒的内在质量[15]。通过对芦丁含量及转移率的测定，并以槐米标准汤剂为参照基准，对槐米进行质量评价，全面反映了槐米配方颗粒量值传递情况，从而实现配方颗粒质量专属性与整体性的综合管控，提高了配方颗粒质量整体控制水平。