枸杞多糖调节Nrf2/HO-1/GPX4 铁死亡途径对妊娠期糖尿病大鼠胰岛素抵抗的改善作用

张翠翠，谢 玲，孙文萍

（青海红十字医院产一科，青海 西宁 810099）

妊娠期糖尿病（GDM） 是首次出现在妊娠期的糖尿病，胰岛素抵抗是其主要病理特征，可阻碍机体有效利用胰岛素，导致血糖不受控地升高，严重影响胎儿生长发育，极大增加孕妇分娩结局不良的风险［1-2］。氧化应激和炎症反应与GDM 患者胰岛素抵抗的增强密切相关，可影响糖脂代谢，导致血糖升高，并引发高血脂及肥胖，通过抗炎、抗氧化和胰岛素增敏可有效改善孕妇肥胖症状，利于胎儿发育及产妇安全分娩［3］。枸杞多糖是枸杞子的主要活性成分，可改善机体糖代谢紊乱［4］，并可通过抑制炎症反应减轻糖尿病大鼠肾功能损伤［5］。铁死亡在2 型糖尿病、GDM的发生发展过程中起到关键调控作用，抑制铁死亡可减弱胰腺β 细胞丢失和功能障碍［6］，减轻高糖刺激下的滋养层细胞氧化应激损伤，改善GDM 症状［7］。促进核因子E2 相关因子2 （Nrf2） /血红素加氧酶-1 （HO-1） /谷胱甘肽过氧化酶4 （GPX4） 表达可抑制炎症和过氧化反应，减轻细胞铁死亡，改善糖尿病肾病症状［8］。因此Nrf2/HO-1/GPX4信号可做为防治GDM 的潜在作用靶点，但枸杞多糖是否可通过调节该途径改善GDM 大鼠胰岛素抵抗，目前还尚未研究清楚。本研究以枸杞多糖干预GDM 大鼠，探究其作用机制，以期为其深入研究提供依据。

1 材料

1.1 动物 SPF 级SD 大鼠购自湖北省实验动物研究中心，实验动物生产许可证号SCXK （鄂） 2015-0018，雌雄比例为2 ∶1，雄性体质量190～210 g，雌性体质量170 ～190 g。严格遵循《中华人民共和国实验动物管理条例》 的规定，并经过青海红十字医院动物伦理委员会批准 （伦理号202102-11），于青海红十字医院动物中心分笼适应饲养，实验动物使用许可证号SYXK （青） 2020-0001，每笼5 ～6只，实验操作均符合3R 原则。

1.2 试剂与药物 枸杞多糖 （纯度≥90%，批号20170523），生理盐水溶解混匀，制得质量浓度为10、20、40 mg/mL 的枸杞多糖药液［9］； 铁死亡抑制剂ferrostatin-1（纯度＞98.00%，批号20160213），生理盐水溶解混匀，制得质量浓度为0.07 mg/mL 的ferrostatin-1 药液［10］。链脲佐菌素（纯度≥98%，批号20190406） 购自北京索莱宝科技有限公司； ML385 （纯度＞98.00%，批号20150427） 购自美国Glpbio 公司； 全蛋白提取试剂盒（批号20180426）、白细胞介素-6 （IL-6） 测试盒（批号20141120）、羊抗兔二抗（批号20170711）、白细胞介素-18 （IL-18） 测试盒（批号20181105）、BCA 法总蛋白定量检测试剂盒 （批号20180921） 购自南京建成生物工程研究所有限公司； 丙二醛（MDA） 试剂盒 （批号20190610）、超氧化物歧化酶（SOD） 试剂盒（批号20190421）、兔源β-actin 一抗（批号20131103） 购自上海碧云天生物技术有限公司； 兔源长链脂酰辅酶A 合成酶4 （ACSL4） 一抗（批号20150622）、兔源环加氧酶2 （PTGS2） 一抗（批号20160321）、兔源Nrf2 一抗 （批号20140724）、兔源GPX4 一抗 （批号20140724）、兔源HO-1 一抗（批号20190417） 购自英国Abcam 公司。

1.3 仪器 全自动干式生化分析仪（型号SD1） 购自成都斯马特科技有限公司； 葡萄糖/乳酸分析仪（型号BIOSEN C＿Line） 购自北京德福康科贸有限公司； 多功能酶标仪（型号SpectraMax iD3） 购自美国Molecular Devices 公司；电泳仪（型号JS-power600）、化学发光成像系统（型号JS-1070P） 购自上海培清科技有限公司； 快速湿转仪（型号eBlot L1） 购自南京贝登医疗股份有限公司。

2 方法

2.1 GDM 大鼠模型制备及分组干预 以2 ∶1 的比例将性成熟雌、雄大鼠合笼，次日检查阴栓即得到孕鼠43 只，标记为妊娠第1 天，同时腹腔注射45 mg/kg 链脲佐菌素（以柠檬酸缓冲液溶解），3 d 后采集尾静脉血，检测空腹血糖（FBG），选择FBG≥16.7 mmol/L 的孕鼠作为造模成功大鼠进入后续实验［11］。40 只造模成功的大鼠以随机数表法分为模型组，枸杞多糖低、中、高剂量组（100、200、400 mg/kg），ferrostatin-1 组（0.7 mg/kg），每组8 只。另设对照组注射等体积柠檬酸缓冲液。

枸杞多糖各剂量组孕鼠分别灌胃给予枸杞多糖药液10 mL/kg，同时腹腔注射生理盐水10 mL/kg； ferrostatin-1 组孕鼠灌胃给予生理盐水10 mL/kg，同时腹腔注射ferrostatin-1 药液10 mL/kg； 对照组、模型组孕鼠灌胃并腹腔注射给予生理盐水10 mL/kg，各组孕鼠均于妊娠第4 天后给药，每天1 次，连续14 d。

2.2 大鼠胰岛素抵抗指数检测 末次给药24 h 后，采集各组大鼠尾静脉血，葡萄糖/乳酸分析仪检测FBG 水平，全自动分析仪检测胰岛素（FINS） 水平，计算胰岛素抵抗指数（IRI），公式为IRI ＝FBG×FINS/22.5，评估胰岛素抵抗水平。

2.3 大鼠IRI 和血脂检测 按“2.1” 项下方法制备GDM大鼠模型，随机分为模型组、枸杞多糖（400 mg/kg） 组、ML385 （Nrf2 抑制剂，30 mg/kg） 组、枸杞多糖 （400 mg/kg） ＋ML385 （30 mg/kg） 组，每组8 只； 另设对照组，注射等体积柠檬酸缓冲液。参照“2.1” 项下给药方法分组给药，枸杞多糖（灌胃） 与ML385 （腹腔注射）［12］的剂量分别为400、30 mg/kg，同样于妊娠第4 天后给药，每天1 次，连续14 d。

末次给药24 h 后，采集各组大鼠尾静脉血，检测FBG、FINS 水平，并计算IRI，同时以全自动分析仪检测孕鼠总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG） 水平。

2.4 大鼠母体与胎鼠体质量检测 末次给药24 h 后，各组大鼠置于乙醚气体中麻醉，采集腹主动脉血1.3 mL，离心吸取上清，分组标记后于－80 ℃保存备用。测得各组孕鼠体质量后断头处死，打开子宫取出胎鼠，无流产记录，计数胎鼠数目，测得所有胎鼠体质量后算出平均值，分离子宫内膜组织，剪下0.6 g 于液氮中保存备用。

2.5 ELISA 法检测大鼠血清IL-18、IL-6、SOD、MDA 水平 以冰水浴溶解“2.4” 项下血清后，按照相关试剂盒说明书操作，检测血清IL-18、IL-6、SOD、MDA 水平。

2.6 Western blot 法检测大鼠PTGS2、ACSL4、Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表达 取各组大鼠液氮处理的子宫内膜组织，研碎，提取蛋白并定量后，每组取20 μg 总蛋白煮沸变性，上样电泳，湿转，以脱脂奶粉溶液封闭，经ACSL4、PTGS2、Nrf2、HO-1、GPX4 兔源一抗孵育、漂洗、羊抗兔二抗孵育、漂洗后，采用化学发光法显影，通过化学发光成像系统采集蛋白条带图像，以β-actin 为内参，分析灰度值，计算各组蛋白相对表达量。

2.7 统计学分析 通过SPSS 24.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 枸杞多糖对GDM 大鼠FBG、FINS、IRI 的影响 与对照组比较，模型组大鼠FBG、FINS、IRI 升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠FBG、FINS、IRI 降低（P＜0.05），并且枸杞多糖作用呈剂量依赖性； 与枸杞多糖高剂量组比较，ferrostatin-1 组大鼠FBG、FINS、IRI 升高（P＜0.05），见表1。

表1 枸杞多糖对GDM 大鼠FBG、FINS、IRI 的影响（±s，n＝8）

表1 枸杞多糖对GDM 大鼠FBG、FINS、IRI 的影响（±s，n＝8）

注： 与对照组比较，∗P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与枸杞多糖高剂量组比较，＆P＜0.05。

组别FINS/（IU·L－1） FBG/（mmol·L－1）IRI对照组8.34±0.724.73±0.451.75±0.36模型组21.30±2.09∗17.34±1.36∗ 16.42±1.87∗枸杞多糖低剂量组 17.25±1.21＃13.26±1.04＃10.17±1.04＃枸杞多糖中剂量组 13.16±0.93＃9.17±0.68＃5.36±0.78＃枸杞多糖高剂量组 9.16±1.02＃5.32±0.47＃2.17±0.42＃ferrostatin-1 组13.08±1.07＃＆9.12±0.79＃＆5.30±0.86＃＆

3.2 抑制Nrf2 逆转枸杞多糖对大鼠FBG、FINS、IRI 的影响 与对照组比较，模型组大鼠FBG、FINS、IRI 升高（P＜0.05）； 与模型组、枸杞多糖＋ML385 组比较，枸杞多糖组大鼠FBG、FINS、IRI 均降低（P＜0.05），ML385 组大鼠FBG、FINS、IRI 均升高（P＜0.05），见表2。

表2 抑制Nrf2 对GDM 大鼠FBG、FINS、IRI 的影响（±s，n＝8）

表2 抑制Nrf2 对GDM 大鼠FBG、FINS、IRI 的影响（±s，n＝8）

注： 与对照组比较，∗P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与枸杞多糖＋ML385 组比较，△P＜0.05。

组别FINS/（IU·L－1） FBG/（mmol·L－1）IRI对照组8.21±0.674.76±0.511.74±0.41模型组21.62±1.90∗17.42±1.45∗16.74±1.51∗枸杞多糖组9.24±0.62＃△5.53±0.34＃△2.27±0.29＃△ML385 组30.15±0.59＃△23.79±1.63＃△31.88±3.17＃△枸杞多糖＋ML385 组 20.13±1.7216.81±1.0215.04±0.84

3.3 枸杞多糖对大鼠血脂水平的影响 与对照组比较，模型组大鼠血清TG、TC 水平升高（P＜0.05）； 与模型组、枸杞多糖＋ML385 组比较，枸杞多糖组大鼠血清TG、TC 水平降低（P＜0.05），ML385 组大鼠血清TG、TC 水平升高（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠血清TG、TC 水平比较（±s，n＝8）

表3 各组大鼠血清TG、TC 水平比较（±s，n＝8）

注： 与对照组比较，∗P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与枸杞多糖＋ML385 组比较，△P＜0.05。

组别TG/（mmol·L－1）TC/（mmol·L－1）对照组0.45±0.091.41±0.32模型组1.71±0.18∗6.83±0.75∗枸杞多糖组0.50±0.14＃△1.52±0.36＃△ML385 组2.92±0.22＃△10.91±0.58＃△枸杞多糖＋ML385 组1.64±0.136.41±0.62

3.4 枸杞多糖对大鼠母体及胎鼠体质量的影响 与对照组比较，模型组大鼠母体体质量、胎鼠体质量升高 （P＜0.05）； 与模型组、枸杞多糖＋ML385 组比较，枸杞多糖组大鼠母体体质量、胎鼠体质量降低（P＜0.05），ML385 组大鼠母体体质量、胎鼠体质量升高（P＜0.05），见表4。

表4 各组大鼠母体及胎鼠体质量比较（±s，n＝8）

表4 各组大鼠母体及胎鼠体质量比较（±s，n＝8）

注： 与对照组比较，∗P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与枸杞多糖＋ML385 组比较，△P＜0.05。

组别母体体质量/g 平均子鼠数量/只 胎鼠体质量/g对照组310.48±4.1210.50±1.844.22±0.15模型组361.23±5.36∗11.13±1.685.70±0.42∗枸杞多糖组315.02±6.03＃△10.75±1.524.84±0.36＃△ML385 组389.78±3.92＃△10.25±1.466.85±0.39＃△枸杞多糖＋ML385 组 356.84±3.2810.88±1.345.36±0.37

3.5 枸杞多糖对大鼠血清IL-6、IL-18、SOD、MDA 水平的影响 与对照组比较，模型组大鼠血清IL-6、IL-18、MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 水平降低（P＜0.05）； 与模型组、枸杞多糖＋ML385 组比较，枸杞多糖组大鼠血清IL-6、IL-18、MDA 水平降低（P＜0.05），SOD 水平升高（P＜0.05），ML385 组大鼠血清IL-6、IL-18、MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 水平降低（P＜0.05），见表5。

表5 各组大鼠血清IL-6、IL-18、SOD、MDA 水平比较（±s，n＝8）

表5 各组大鼠血清IL-6、IL-18、SOD、MDA 水平比较（±s，n＝8）

注： 与对照组比较，∗P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与枸杞多糖＋ML385 组比较，△P＜0.05。

组别IL-18/（ng·L－1）IL-6/（ng·L－1）SOD/（U·L－1）MDA/（nmol·L－1）对照组26.41±3.1250.63±9.8227.56±3.6413.81±2.24模型组58.67±6.03∗189.75±34.21∗10.02±1.13∗36.92±4.13∗枸杞多糖组28.52±3.96＃△59.02±10.25＃△24.97±4.01＃△15.62±2.46＃△ML385 组79.24±8.31＃△253.18±15.93＃△3.12±0.45＃△50.31±5.39＃△枸杞多糖＋ML385 组56.13±4.02182.91±27.3611.93±1.2734.75±3.62

3.6 枸杞多糖对大鼠子宫内膜组织PTGS2、ACSL4、Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜组织PTGS2、ACSL4 蛋白表达升高（P＜0.05），Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表达降低（P＜0.05）； 与模型组、枸杞多糖＋ML385 组比较，枸杞多糖组大鼠子宫内膜组织PTGS2、ACSL4 蛋白表达降低 （P＜0.05），Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表达升高（P＜0.05），ML385 组大鼠子宫内膜组织PTGS2、ACSL4 蛋白表达升高（P＜0.05），Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表达降低（P＜0.05），见图1、表6。

图1 各组大鼠子宫内膜组织ACSL4、PTGS2、Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白条带图

表6 各组大鼠子宫内膜组织PTGS2、ACSL4、Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表达比较（±s，n＝8）

表6 各组大鼠子宫内膜组织PTGS2、ACSL4、Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表达比较（±s，n＝8）

注： 与对照组比较，∗P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与枸杞多糖＋ML385 组比较，△P＜0.05。

组别ACSL4PTGS2Nrf2HO-1GPX4对照组0.48±0.060.35±0.040.87±0.090.94±0.141.01±0.22模型组1.21±0.14∗0.96±0.11∗0.43±0.05∗0.47±0.06∗0.52±0.07∗枸杞多糖组0.59±0.07＃△0.43±0.05＃△0.81±0.10＃△0.90±0.12＃△0.95±0.06＃△ML385 组1.75±0.15＃△1.41±0.18＃△0.12±0.03＃△0.13±0.02＃△0.20±0.04＃△枸杞多糖＋ML385 组1.16±0.130.92±0.160.45±0.070.51±0.100.54±0.12

4 讨论

随着生活水平提高，人们饮食结构改变，营养过剩普遍存在，我国GDM 发生率也逐年提升，严重威胁妇女生殖健康［13-14］。本研究于SD 大鼠腹腔内注射链脲佐霉素诱导建立GDM 模型，结果显示链脲佐菌素注射可破坏胰岛细胞功能，升高血糖血脂水平，促使炎性细胞因子合成释放，进而引发炎症与氧化应激，增加血中胰岛素水平，造成胰岛素抵抗，最终导致母体及胎鼠肥胖，体质量明显增加，表明GDM 模型建立成功。

胰岛素抵抗是引发糖脂代谢紊乱，促使GDM 发生的主要病理基础，炎症反应、氧化应激等多种致病因素参与其中，限制炎症反应、降低氧化应激可提高胰岛素敏感性，减轻GDM 孕妇高血糖症状［15-16］。枸杞多糖具有降糖降脂、抗氧化应激、消炎抑菌及增强免疫力等多种功效，能抑制NF-κB 信号激活，减少高糖诱导的促炎因子合成［17］，降低2 型糖尿病大鼠血糖并减弱其胰岛素抵抗［18］。本实验以不同剂量枸杞多糖处理GDM 大鼠，可降低FINS、FBG 水平及IRI，具有剂量依赖性，表明枸杞多糖可改善糖代谢紊乱，有效降低血糖水平，减弱胰岛素抵抗。以高剂量枸杞多糖处理GDM 大鼠，不仅可降低FINS、FBG 水平及IRI，还可降低血脂及炎性细胞因子水平，减弱氧化应激，最终改善母体及胎鼠肥胖症状。

铁死亡在GDM 的发病机制及病情发展中发挥着重要作用，减弱铁死亡可减轻氧化应激损伤，有效改善GDM 大鼠子宫和胎盘功能失调［19］。本研究以铁死亡特异性抑制剂ferrostatin-1 处理GDM 大鼠，可明显降低FINS、FBG 水平及IRI，表明铁死亡参与介导GDM 的发生发展，抑制铁死亡可减轻GDM 大鼠胰岛素抵抗，改善母体及胎鼠肥胖症状。Nrf2/HO-1/GPX4 信号可抑制早期炎症和氧化应激，降低胰岛细胞铁死亡水平，改善胰岛功能障碍，促使移植的胰岛存活，有效治疗1 型糖尿病［20］。本研究以Nrf2 抑制剂ML385 处理GDM 大鼠，可降低Nrf2/HO-1/GPX4 通路蛋白表达，促使炎性细胞因子进一步合成释放，升高氧化应激水平，使铁死亡标志蛋白ACSL4［11］、PTGS2［19］表达升高，促进铁死亡，加重孕鼠胰岛素抵抗及肥胖症状。当ML385和枸杞多糖联合处理GDM 大鼠，ML385 可减弱枸杞多糖对铁死亡及胰岛素抵抗的抑制作用，并逆转其对GDM 大鼠母体及胎鼠健康的保护作用。

综上所述，枸杞多糖可上调Nrf2/HO-1/GPX4 通路蛋白表达，从而减少炎性细胞因子合成释放，减轻氧化应激，抑制铁死亡途径，增强胰岛素敏感性，促使糖脂代谢恢复，减弱胰岛素抵抗。本研究为枸杞多糖的临床推广应用、克服GDM 潜在危害、预防相关疾病进一步发展提供了新的科学依据，并为GDM 的防治做出了一定贡献。