不同玉米自交系对环磺酮的敏感性差异研究

高 玥, 黄冀楠, 许 贤, 李 杰, 李秉华, 赵铂锤, 祁志尊,王贵启, 郭建青, 刘小民*,

(1.河北北方学院 农林科技学院，河北 张家口 075000；2.河北省农林科学院 粮油作物研究所，河北省作物栽培生理与绿色生产重点实验室，石家庄 050035；3.河北省石家庄市发展和改革委员会，石家庄 050011；4.河南省太行山林业有害生物野外科学观测研究站，河南 安阳 455099)

玉米是我国的主要粮食作物，而杂草是影响玉米品质和产量的重要因素之一[1]。目前，施用化学除草剂仍是防除玉米田杂草的主要措施。研究表明，杂草已对多类除草剂产生了严重的抗性[2]。对羟基苯基丙酮酸双氧化酶 (4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD) 为20 世纪90 年代新发现的除草剂作用靶标酶之一。HPPD 可以催化对羟基丙酮酸转化为尿黑酸，进而转化为光合作用中电子传递所需要的质体醌和生育酚[3]。此类除草剂能竞争抑制植物体内HPPD 的活性，使植物出现失绿、褪色症状，组织坏死，最终导致植物死亡[4]。该类除草剂因具有生物活性高、对作物安全性好、可用于防除抗性杂草等特点，成为近几年除草剂研发的热点。

环磺酮是2007 年由拜耳公司研发的HPPD 抑制剂类除草剂，具有内吸性和选择性，可以用于玉米、向日葵等作物田防除多种阔叶杂草和禾本科杂草。环磺酮2021 年在中国登记后，近几年在我国被广泛的推广应用，具有广谱、高效和低残留的优点，施药后植物的受害症状主要为叶片白化，植株矮小，严重时整株死亡[5]。研究表明，环磺酮对玉米田大多数禾本科和阔叶杂草具有很好的防治效果，且对那些已对麦草畏、草甘膦和乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制剂类除草剂产生抗性的杂草有灭杀效果[6]。与同类型的除草剂硝磺草酮相比，环磺酮的除草活性更高[7]，更耐雨水冲刷，且除草范围广，对后茬作物没有影响[8-10]。

玉米对除草剂的敏感性与其自身的遗传基础有关。有研究表明，玉米5 号染色体短臂上的CYP等位基因nsf1与玉米对烟嘧磺隆、甲酰胺磺隆、硝磺草酮等除草剂的敏感性密切相关。Williams等[11]通过玉米对烟嘧磺隆和硝磺草酮的敏感性差异分析，将249 份玉米材料分为纯合敏感基因型(nsf1nsf1)、杂合耐药基因型 (NSF1nsf1) 和纯合耐药基因型 (NSF1NSF1) 3 类。虽然环磺酮对玉米的安全性较好，并可应用于爆裂玉米、甜玉米等特种玉米田，但仍有研究表明，部分甜玉米品种对环磺酮高度敏感。Bollman 等[12]发现，用环磺酮处理甜玉米品种‘Merit’ 7 d 后有52% 的叶片白化，14 d 后植株严重枯萎死亡。Williams 等[11]研究发现，环磺酮按有效成分184 g/hm2处理7 d后，对‘Shogun’、‘Merit’、‘177A’等7 个甜玉米品种可造成56%～100% 的药害。我国玉米品种繁多，明确骨干自交系对除草剂的耐药性水平，对指导除草剂在玉米田的安全应用、避免除草剂药害发生、保障玉米生产安全具有重要的社会意义和经济意义。本研究以‘Mo17’、‘PH6WC’、‘J525’和‘KH8’等玉米自交系为试验对象，明确了环磺酮对耐、感玉米生长发育及体内生理生化指标的影响差异，旨在为环磺酮在玉米田的安全使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试药剂95%环磺酮（(tembotrione）原药和8%环磺酮可分散油悬浮剂 (tembotrione 8% OD)，均由安徽久易农业股份有限公司生产；植物油助剂GY-Tmax，由北京广源益农化学有限责任公司提供。供试自交系H B 0 5 (‘M o 1 7’)、H B 0 9(‘PH6WC’) 为耐药型玉米，HB39 (‘J525’) 和HB82(‘KH8’) 为敏感型玉米，两者均由河北省农林科学院粮油作物研究所提供。

1.2 环磺酮对玉米苗期生长的影响

采用室内生物测定法[13]。选取籽粒饱满、大小匀称的玉米种子放入高10 cm、直径11 cm 育苗盆中培养，温度25 ℃，每盆两粒种子，3 次重复。待玉米长到三叶一心时，使用3WP-2000 型喷雾塔 (农业农村部南京农业机械化研究所) 进行茎叶喷雾处理，喷雾压力0.3 MPa，喷液量450 L/hm2。环磺酮处理剂量 (有效成分，下同) 敏感型玉米为：0、30、60、90、120、180 和240 g/hm2，耐药型玉米为：0、120、240、360、480、600 和720 g/hm2。于药后14 d 测定玉米株高和鲜重，计算抑制率。

1.3 环磺酮对玉米主根生长的影响

采用垂直根长法[14]。称取环磺酮原药1.030 g，用丙酮溶解后用蒸馏水定容到1000 mg/L，作为母液。用蒸馏水将母液分别稀释到0.1、1、10 和100mg/L，以清水为对照。将玉米种子用酒精冲洗1 min，用次氯酸钠浸泡10 min 后，再用自来水冲洗3 次，最后用蒸馏水将种子浸泡24 h。第2 天将处理好的玉米种子置于玻璃板上，用两张滤纸固定，将玻璃板垂直放在保鲜盒中，保鲜盒中放入不同浓度的药液。于7 d 后测量主根根长。以抑制率概率值 (y) 和浓度对数值 (x) 建立回归方程 (y=a+bx)，计算IC50值 (mg/L)。

1.4 环磺酮对玉米叶片类胡萝卜素和叶绿素含量的影响

按照1.2 节中的方法培养玉米，待其长到三叶一心时，采用环磺酮按有效成分120 g/hm2处理。分别在施药后0、3、5 和7 d 采集0.1 g 新鲜的玉米叶片，去掉中脉，在黑暗条件下研磨后倒入10 mL试管中，加入V(乙醇) :V(蒸馏水) = 95 : 5 混合液，于黑暗条件下浸提3 h。待材料完全变白后，取浸提液于96 孔板中，将波长分别调至665、649 和470 nm 处读取吸光值 (A)。按公式 (1)～(4)计算叶绿素a 含量、叶绿素b 含量、叶绿素总含量和类胡萝卜素含量。

其中，Ca为叶绿素a 含量，Cb为叶绿素b 含量，Ct为叶绿素总含量，Cc为类胡萝卜素含量，单位均为mg/g；V为提取液体积，mL；D为稀释倍数；m为样本质量，g。

1.5 超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化物酶 (POD)活性测定

按照1.2 节的方法培养玉米，待其长到三叶一心时，采用环磺酮有效成分120 g/hm2处理。分别于施药后0、1、3、5 和7 d 采集新鲜的玉米叶片，冰浴匀浆，使用索莱宝 (Solarbio) 生物科技有限公司提供的SOD 和POD 试剂盒进行测定。

1.6 数据处理与分析

数据采用Microsoft Excel 及DPS 17.1 软件进行处理，并利用新复极差法(Duncan's 法)进行单因素差异显著性分析，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 环磺酮对玉米幼苗生长的影响

2.1.1 环磺酮对玉米株高的影响 环磺酮按30 g/hm2(有效成分，下同) 施用4 d 后，敏感型玉米植株开始表现出药害症状，叶片出现白化现象；对玉米株高的抑制率随着用药量的增加而逐渐增大，其中在60 g/hm2处理下对HB82 株高的抑制率达52.87%，在240 g/hm2处理下抑制率高达64.63%。而耐药型玉米在施用环磺酮后，植株叶片并未出现白化现象，各处理间株高抑制率变化幅度较小，在720 g/hm2处理下对HB05 和HB09 的株高抑制率分别为48.61%和38.05% (图1)。

图1 环磺酮对玉米株高的影响Fig.1 Effect of tembotrione on maize plant height

2.1.2 环磺酮对玉米鲜重的影响 由图2 可知，环磺酮对不同玉米自交系的鲜重抑制率存在明显差异。在30 g/hm2处理下，对敏感型玉米HB82、HB39 的鲜重抑制率分别为38.59%和24.94%，在240 g/hm2处理下对其鲜重抑制率分别高达70.06%和66.02%。而耐药型玉米HB05 在施用环磺酮120 g/hm2后，鲜重抑制率仅为4.44%，720 g/hm2处理下鲜重抑制率为21.93%；HB09 在120～720 g/hm2处理下，鲜重抑制率为22.39%～43.63%。

图2 环磺酮对玉米鲜重的影响Fig.2 Effect of tembotrione on maize fresh weig ht

2.2 环磺酮对玉米主根生长的影响

从图3 可以看出，环磺酮对玉米主根生长有一定的抑制作用，在同一浓度处理下，对敏感型玉米主根根长的抑制作用明显高于耐药型玉米，浓度越高对主根根长的抑制作用越明显。1000 mg/L处理对敏感型玉米HB82 和HB39 的根长抑制率分别为90.94%和85.35%，对耐药型玉米HB05 和HB09 的抑制率分别为76.65%和78.07%。由表1数据可以看出，环磺酮对敏感型HB82 和HB39的IC50值分别为13.48 和16.13 mg/L，对耐药型玉米HB05 和HB09 的IC50分别为223.50 和37.42 mg/L，两者的IC50值相差较大。

表1 环磺酮对玉米主根的影响(120 g a.i./hm2)Table 1 Effect of tembotrione on taproots of maize (120 g a.i./hm2)

图3 环磺酮对玉米主根生长的影响Fig.3 Effect of tembotrione on the growth of maize taproots

2.3 环磺酮对玉米幼苗类胡萝卜素和叶绿素含量的影响

HPPD 抑制剂类除草剂可以阻断植物体内酪氨酸的正常代谢，导致类胡萝卜素的缺乏, 从而诱导叶绿素光氧化作用减弱，影响植物的光合作用。施用环磺酮后，叶绿素a、b，叶绿素总含量和类胡萝卜素含量均随用药时间的增加呈现不同程度的下降趋势 (表2)。施药7 d 后，敏感型玉米HB82 和HB39 体内类胡萝卜素含量分别下降83.72%和74.02%，耐药型玉米HB05 和HB09 分别下降40.83%和33.33%；敏感型玉米和耐药型玉米的叶绿素总含量有明显的差异，敏感型玉米HB82 的下降趋势最明显，下降87.76%，而耐药型玉米HB09 下降33.65%；叶绿素a 和叶绿素b的变化趋势与叶绿素总含量变化趋势一致，敏感型玉米HB82 叶绿素a 含量由0.837 mg/g 下降至0.102 mg/g，HB39 由0.540 mg/g 下降至0.159 mg/g；耐药型玉米HB05 由0.546 mg/g 下降至0.217 mg/g，HB09 由0.668 mg/g 下降至0.442 mg/g。HB82 和HB39 叶绿素b 含量分别下降0.184 和0.086 mg/g，HB09 和HB05 分别下降0.055 和0.079 mg/g。表明环磺酮对敏感型玉米叶片中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量和类胡萝卜素含量影响较大，叶片受害较重，光合作用受到严重抑制。而耐药型玉米在施用环磺酮后，叶片受害较轻，对叶绿素a、叶绿素b，叶绿素总含量和类胡萝卜素含量影响较小。

表2 环磺酮对玉米叶片类胡萝卜素和叶绿素含量的影响 (120 g a.i./hm2)Table 2 Effect of tembotrione on carotenoids and chlorophyll content in maize leaves (120 g a.i./hm2)

2.4 环磺酮对不同玉米自交系SOD 和POD 酶活性的影响

SOD 活性测定结果如图4 所示，与对照组相比，环磺酮处理诱导了不同玉米自交系体内SOD 酶活性的增加。不同玉米自交系SOD 酶活性均呈现出先上升后下降的趋势，在第3 天出现最高值，然后下降。敏感型玉米和对照组相比活性变化幅度大，药后3 d 与对照组相比，敏感型HB82活性提高69.02%，HB39 提高93.63%；而耐药型玉米HB05 和HB09 的SOD 酶活性与对照组相比变化幅度不大。

图4 环磺酮对玉米叶片SOD 酶活性影响 (120 g a.i./hm2)Fig.4 Effect of tembotrione on SOD enzyme activity in maize leaves (120 g a.i./hm2)

POD 活性测定结果 (图5) 表明，施用环磺酮后，不同玉米自交系体内POD 酶活性均高于对照组。整体呈先上升后下降趋势，HB82、HB39 和HB05 在药后5 d 出现最高值，HB09 在药后3 d 出现最高值。与对照组相比，药后5 d， HB82 升高182.19%，HB39 升高163.23%；药后3 d，HB09升高28.09%，HB05 变化最小，仅升高4.20%。敏感型玉米与耐药型玉米相比具有较大的差异。

图5 环磺酮对玉米叶片POD 酶活的影响Fig.5 Effect of tembotrione on POD enzyme activity in maize leaves

3 结论与讨论

除草剂对玉米的安全性除了受气候和土壤等环境因素的影响之外，还与玉米品种密切相关[15]。本研究借鉴董晓雯等[16]和陈锡岭等[17]的方法，分析了环磺酮胁迫对玉米幼苗和主根生长的影响。结果表明，环磺酮对玉米幼苗生长和主根根长具有不同程度的抑制作用，不同玉米自交系对环磺酮的耐药性存在明显差异，环磺酮120 g/hm2处理对敏感型玉米产生伤害，影响其光合作用，阻碍玉米生长发育所需物质的运输，导致玉米营养物质供应不足，代谢能力减弱，药害严重；而对耐药型玉米的生长发育无明显影响。敏感型玉米HB82和HB39 在环磺酮30 g/hm2处理下叶片出现白化，而生产上常用的骨干自交系‘Mo17’ (HB05)、‘PH6WC’ (HB09) 即使在720 g/hm2剂量下叶片也没有出现失绿现象。‘Mo17’在育种中做出巨大贡献，先后培育出‘丹玉13’和‘中单2 号’等品种。‘PH6WC’培育的杂交后代有‘先玉335’，我们在前期研究中验证了‘先玉335’为耐环磺酮的品种 (结果未发表)。已有研究表明，不同玉米品种对不同类型除草剂的敏感性存在显著差异。董晓雯等[16]测定了32 个玉米品种对有效成分60 g/hm2烟嘧磺隆的敏感性，发现‘泰玉2 号’等7 个玉米品种对烟嘧磺隆敏感，植株生长受到严重抑制，而‘农大2008’等4 个玉米品种生长正常，无明显药害症状。谢娜等[18]研究发现，氯吡嘧磺隆对甜玉米的IC10值为94.87 g/hm2(有效成分，下同)，而对‘强盛16’的IC10值为230.19 g/hm2，相差2.43 倍。郭玉莲等[19]研究表明，‘吉单27’、‘先玉335’、‘东农888’和‘垦粘1 号’对氟磺胺草醚敏感性差异显著，耐药倍数相差5.71～8.83 倍。

HPPD 抑制剂类除草剂可以阻碍玉米体内质体醌 (PQ) 的合成，质体醌作为光合作用中关键的辅助因子，影响类胡萝卜素的生成，使植物逐渐白化，叶绿素含量下降[20]。叶绿素含量的高低能反映作物光合作用状态的变化，因此叶绿素含量是反映逆境胁迫下光合作用的重要指标。本研究中，随着施药时间的推移，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量和类胡萝卜素含量均呈不同程度的下降趋势，其中敏感型玉米的下降幅度大于耐药型玉米，二者差异明显。郭玉莲等[19]研究了不同玉米品种对氟磺胺草醚的敏感性差异，发现施用氟磺胺草醚后不论是敏感还是耐药型玉米体内叶绿素含量均受到抑制，但对耐药品种叶绿素抑制率变化幅度较敏感品种小，二者间差异极显著。王一[21]对不同耐旱胁迫下两个玉米自交系苗期生长发育以及生理生化特性的研究发现，耐旱玉米自交系体内叶绿素a、叶绿素b 和叶绿素总含量受胁迫影响较敏感型玉米自交系小。

除草剂使用不当容易对玉米造成伤害，当玉米受到除草剂等非生物胁迫时，细胞内会生成大量的活性氧如超氧自由基、过氧化氢等，植物体内抗氧化系统为防止细胞的氧化损伤，启动保护酶来维持植物细胞的稳定。超氧化物歧化酶(SOD) 和过氧化物酶 (POD) 是植物体内重要的保护酶，是评价植物氧化反应的重要指标。本研究发现，环磺酮胁迫诱导了玉米体内SOD 和POD活性的增加，整体呈先上升后下降的趋势，其中敏感型玉米的增长幅度明显高于耐药型玉米。石小堰[22]研究表明，在2,4-D 丁酯、乙草胺和莠去津3 种除草剂处理下，抗感玉米体内SOD 和POD的活性与对照组相比都有一定的升高。高鹏[23]关于谷子和玉米对烟嘧磺隆敏感性差异的生理机制研究发现，玉米施用烟嘧磺隆后体内S O D和POD 活性升高，其中 ‘农大108’和‘迪甜8 号’玉米体内SOD 和POD 活性随用药时间的推移呈现先升高后降低的趋势。

有关不同自交系玉米品种对环磺酮敏感性差异的生理机制，还需要从酶学、生理学等方面进行深入研究。