酱酒1、2轮次窖池不同醅层微生态结构与酸性化合物组成解析及其相关性预测

万旗钰，程玉鑫，黄永光, ，佘荣书，邓昌伟，左乾程

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州省酣客君丰酒业有限公司，贵州 仁怀 564500）

酱香白酒具有独特的酿造工艺，其复杂的酿造微生物群落构成了酱香白酒独特的酒体风格，近年来广受消费者欢迎[1-2]。酱香白酒无论是酿造过程中的酒醅还是成品酒，其代谢产物及风味物质中，酸类化合物占比较大，尤其是乳酸和乙酸，因此“酸高”成为酱香白酒一大特点[3]。酿造的7 个轮次周期中，前期轮次产酸微生物竞相生长繁殖，造成酒醅酸度的不断增加，后期轮次酸度趋向平稳，1、2轮次是酿造过程中酸度变化较大的时期[4]。因此研究酱香白酒1、2轮次酸类化合物种类及结构可进一步了解其变化趋势。

Song Zhewei等[5]通过超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）和顶空固相微萃取-气相-质谱联用技术共鉴定出酱香型酒醅中12 种酸（主要是乳酸、乙酸和琥珀酸）。胡小霞等[6]通过高通量测序发现进入窖池发酵后，微生态很快由复杂的多菌属生态结构演替为单一的以Lactobacillus为主导的生态结构。同时Delftia、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Burkholderia和Saccharopolyspora等结构主要会受酸度影响，因此酒醅酸度的变化会改变微生物群落的组成[7]。

由于发酵窖池较深，酒醅在轮次加工过程中均采用“分层起糟”的方式进行处理[8]。取自窖面的酒醅含羰基化合物较多，取自窖中的酒醅含大量多元醇物质，取自窖底的酒醅乙酸乙酯风味较重[9]。造成此差异的可能原因是窖池空间内微生物群落结构差异及变化，导致代谢产物具有差异[10]。但前期研究中鲜见采用分层采样进行分析，缺少对窖池酒醅不同空间位置（上、中、底层）酸类化合物及微生物群落结构的研究。

本研究采用高通量测序技术及UPLC检测技术解析了酱香白酒酿造过程中1、2轮次窖池发酵上、中、底层微生物群落及酸类化合物，对分析酱香白酒1、2轮次窖池不同空间位置酒醅微生物群落结构及酸类化合物种类和变化具有重要意义，旨在为传统白酒固态发酵调控提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品采自贵州省仁怀市酣客君丰酒厂制酒车间发酵窖池2021年12月—2022年2月，1、2轮次窖池发酵酒醅。

E.Z.N.A.Soil DNA试剂盒 美国Omega BioTek公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、引物合成 生工生物工程（上海）股份有限公司；异丙醇、磷酸（均为分析纯）天津市富宇精细化工有限公司；电泳缓冲液、Gengreen染料 北京金博益生物技术有限公司；氢氧化钠（分析纯）中国医药集团有限公司；亚铁氰化钾、硫酸锌（均为分析纯）天津市科密欧化学试剂有限公司；无水磷酸二氢钠、冰乙酸、甲酸、无水柠檬酸（均为标准品，色谱级）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-乳酸、琥珀酸、L-酒石酸、无水草酸（均为标准品，色谱级）北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；高压蒸汽灭菌锅 厦门致微仪器有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 杭州郎基有限公司；DYY-8C电泳仪 北京六一仪器厂；旋涡震荡仪华利达有限公司；超纯水机 德国Think-lab公司；凝胶成像仪 上海天能科技有限公司；MiSeq测序仪 美国Illumina公司；自动点位滴定仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；超高效液相色谱 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

1、2轮次窖池发酵周期为30 d，每隔5 d采样（0、5、10、15、20、25 d和30 d）。样品采集固定跟踪一个窖池，按照窖池空间采集窖池上层酒醅、中层酒醅和底层酒醅，取样点如图1所示，上层按照A、B、C 3 个点采集，中层按照D、E、F 3 个点采集，底层按照G、H、I 3 个点采集，将同层采集的3 个样品等量混合为该空间位置的混合样品。研究共采集126 个发酵酒醅小样，最终混合成42 个样品。

图1 窖池发酵酒醅取样点Fig.1 Sampling points of fermented grains in the fermentation cellar

1.3.2 酒醅总酸含量及pH值测定

总酸含量根据GB 12456—2021《食品中总酸的测定》进行测定；pH值采用酸度计测定。

1.3.3 酒醅预处理及酸类化合物测定

样品预处理参考郎召伟[11]的方法并做修改，准确称取2 g酒醅（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入20 mL超纯水，浸泡1 h后，8000 r/min离心15 min。取4 mL上清液加入106 g/L亚铁氰化钾溶液和300 g/L硫酸锌溶液各1 mL以去除蛋白，涡旋混匀，8000 r/min离心3 min。用注射器吸取上清液后使用0.22 μm针管式滤膜（水系）过滤上清液至液相小瓶中待测。

采用UPLC法检测42 个待测样液，参考文献[12]方法并适当调整。UPLC条件：采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：20 mmol/L NaH2PO4溶液（pH 2.7）；检测波长：210 nm；柱温：35 ℃；流速：0.25 mL/min；进样量：1 μL。将标准品和样品色谱图进行对比，根据保留时间确定样品中各组分的色谱峰，根据每次测定的标准稀释曲线确定样品中酸类产物的含量。

1.3.4 酒醅微生物总DNA提取、PCR扩增及高通量测序

参考文献[5]报道的方法，首先，分别取样品16 g于100 mL离心管中，加入3～5 颗玻璃珠和35 mL灭菌后的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，旋涡振荡7 min，400 r/min低速离心5 min，吸取上清液至已灭菌的50 mL离心管中；其次，加入20 mL PBS至装有样品的100 mL离心管中，旋涡振荡4 min，400 r/min低速离心5 min，收集上清液至已灭菌的50 mL离心管中；最后，将装有上清液的50 mL离心管于离心机12000 r/min离心5 min，弃上清液，收集细胞沉淀。预处理后每个样品的总DNA提取步骤参考E.Z.N.A.Soil DNA试剂盒的操作说明书。细菌PCR扩增引物：341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）；真菌PCR扩增引物：ITS1FI2（5’-GTGARTCATCGAATCTTTG-3’）和ITS2（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。扩增程序：98 ℃预变性30 s，35 个循环（98 ℃变性10 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸10 min。扩增体系：Phusion Hot start flex 2×Master Mix 12.5 µL，正、反向引物各2.5 µL，DNA模板50 ng，使用dd H2O补齐体系至25 µL。

高通量测序得到RawData后，通过Overlap拼接双端数据，并进行质控、嵌合体过滤等操作以获得高质量的CleanData。同时，通过DADA2（divisive amplicon denoising algorithm）软件重复操作以提高生物信息分析的质量。对具有100%相似性的有效序列进行聚类，并将这些序列分类为扩增子序列变体（amplicon sequence variant，ASV）。在各ASV特征序列的基础上，进一步进行多样性分析、物种分类注释和差异分析等数据分析。采用Illumina MiSeq测序平台，分别对细菌16S rRNA基因V3～V4区、真菌ITS3～ITS4区进行高通量测序分析，由联川生物技术股份有限公司（杭州）协助完成。

1.4 数据处理与分析

所有实验均进行3 次重复。通过SPSS 22.0软件进行数据处理及Spearman相关性分析；采用单因素方差分析判断差异显著性（P＜0.05）；利用Origin 8.6软件绘制图表，并进行相关分析。

2 结果与分析

2.1 总酸含量及pH值变化

酱香白酒的固态发酵工艺导致微生物及风味物质空间分布存在差异[10]。随着发酵的进程，2轮次整体pH值（3.585±0.035～3.790±0.010）比1轮次（3.715±0.050～4.597±0.050）低（图2a、b）。其中1轮次pH值从5 d开始快速下降，2轮次从10 d开始快速下降，酒醅pH值下降表示此时微生物快速产酸。到达发酵30 d（发酵终点）pH值基本一致，说明最终两个轮次的酒醅微生物到达所能耐受的最低pH值[13]。

图2 1、2轮次窖池酒醅pH值及总酸含量变化Fig.2 Changes in pH and total acid in fermented grains during the first and second rounds of fermentation

1 轮次总酸含量（（0.379±0.005）～（3.706±0.005）g/kg）比2轮次总酸（（2.032±0.02）～（4.606±0.05）g/kg）低（图2c、d）。多数发酵时间点上、中、底层总酸差异显著，总酸变化规律多数为底层＞中层＞上层，说明底层生酸微生物占据生长优势。

2.2 1、2轮次窖池酒醅酸类化合物结构及分布

从1、2轮次酒醅中共检测出7 种主要酸类化合物（乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸、草酸、柠檬酸和酒石酸）。如图3所示，JYU、JYM、JYB分别为1轮次上、中、底层的酒醅样品，1轮次酒醅中乳酸和乙酸始终保持优势占比，其他酸类化合物占比较小。1轮次上、中和底层酒醅酸类化合物的含量存在规律性波动，均呈现先减少后增加趋势，在30 d时达到最高值。乳酸含量为底层＞中层＞上层，上层从（5.888±0.265）g/kg（0 d）变化到（19.808±0.857）g/kg（30 d），中层从（6.558±0.416）g/kg（0 d）变化到（21.774±0.281）g/kg（30 d），底层从（6.753±0.342）g/kg（0 d）变化到（20.382±0.288）g/kg（30 d）；乙酸含量为中层＞底层＞上层，上层从（5.940±0.334）g/kg（0 d）变化到（15.761±0.566）g/kg（30 d），中层从（6.573±0.291）g/kg（0 d）变化到（16.505±0.057）g/kg（30 d），底层从（6.777±0.357）g/kg（0 d）变化到（21.639±0.498）g/kg（30 d）。其他酸类化合物含量均在（1.937±0.642）g/kg以下，并且在1轮次整个发酵过程中的变化较小。

图3 1轮次窖池发酵酒醅中各酸类化合物含量变化Fig.3 Changes in organic acid contents in fermented grains during the first round of fermentation

如图4所示，JEU、JEM、JEB分别为2轮次上、中、底层的酒醅样品，2轮次与1轮次酒醅酸类化合物变化规律类似。乳酸含量为底层＞中层＞上层，上层从（5.937±0.541）g/kg（0 d）变化到（28.196±0.949）g/kg（30 d），中层从（6.490±0.365）g/kg（0 d）变化到（31.272±0.518）g/kg（30 d），底层从（6.769±0.387）g/kg（0 d）变化到（29.868±0.317）g/kg（30 d）；乙酸含量为上层＞中层＞底层，且差异明显，上层从（5.940±0.414）g/kg（0 d）变化到（12.207±0.595）g/kg（30 d），中层从（6.648±0.512）g/kg（0 d）变化到（11.927±0.329）g/kg（30 d），底层从（6.491±0.395）g/kg（0 d）变化到（10.861±0.916）g/kg（30 d）。其他酸类化合物含量均在（3.505±0.861）g/kg以下。

图4 2轮次窖池发酵酒醅中各酸类化合物含量变化Fig.4 Changes in organic acid contents in fermented grains during the second round of fermentation

乳酸可通过Lactobacillus进行的磷酸己糖途径发酵产生[14]，乙酸主要由酒醅中Saccharomyces的醇酰基转移酶途径产生[15]。2 种酸具有优势占比的原因可能是在发酵阶段，Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Zygosaccharomyces bailii及Lactobacillusspp.均大量表达了丙酮酸代谢中与乙酸和乳酸相关的酶[16]，但不同空间结构微生物群落具有差异性[10]，因此，酒醅中乳酸和乙酸含量随发酵时间和空间结构改变而发生变化。

2.3 细菌及真菌群系结构演替

2.3.1 基于属水平细菌群落动态变化

白酒酿造发酵过程是微生物的代谢及调控过程，微生物在其中发挥着重要作用[17]。如图5 所示，从1 轮次酒醅中共检出150 个主要细菌属，其中Limosilactobacillus是最主要的优势菌群，其上、中、底层不同空间的平均相对丰度分别为46.59%、53.73%和52.06%；其次是Lactobacillus（27.74%、28.38%和27.15%）和Acetobacter（8.05%、6.19%和7.95%）。从2轮次酒醅中共检出201 个主要细菌属，Limosilactobacillus占绝对优势，其相对丰度分别为73.98%（上层）、83.75%（中层）和89.87%（底层）。同样，Wang Huan等[18]在酱香白酒酿造过程也观察到Lactobacillus和Acetobacter为优势细菌属。Zhu Chutian等[19]揭示了不同地区大曲微生物群落和功能特征不同。任宇婷等[20]对比了3 种大曲优势微生物群落，也发现大曲中Limosilactobacillus的平均相对丰度较高。本研究中检出Limosilactobacillus，在其他酱香白酒报道中鲜有检出，因此推测Limosilactobacillus可能来源于大曲。

图5 1、2轮次窖池发酵酒醅中主要细菌属相对丰度堆积柱状图Fig.5 Relative abundance of bacterial genera in fermented grains in the first and second rounds of fermentation

在发酵进程中不同时间上、中、底层酒醅微生物群系差异较大。1轮次发酵至5 d时Limosilactobacillus在上、中、底层的相对丰度分别为58.15%、58.05%和61.65%，25 d时相对丰度分别为32.56%、47.42%和16.16%；而Lactobacillus发酵至5 d时上、中、底层的相对丰度分别为27.81%、20.85%和33.76%，10 d时相对丰度分别为38.81%、43.27%和42.38%，25 d时相对丰度分别为25.56%、31.05%和16.20%。说明10 d后Lactobacillus取代Limosilactobacillus成为发酵优势细菌属，但随着酒醅中酸类化合物的积累，对Lactobacillus自身造成一定的酸胁迫，当其细胞处于高浓度酸性环境中，胞内H＋逐渐积累使得pH值降低，会破坏嘌呤碱基的完整性，影响细胞生长、代谢相关酶的活性，最终导致Lactobacillus生长受限制甚至死亡[21]。因此，25 d时Lactobacillus的相对丰度减少。Acetobacter发酵至5 d时在上、中、底层的相对丰度分别为0.37%、2.47%和0.11%，10 d时相对丰度分别为8.30%、1.30%和0.51%，25 d时相对丰度分别为8.15%、2.92%和20.72%。随着发酵时间的延长和总酸含量的增加，Acetobacter的相对丰度变化趋势与Lactobacillus相反，Acetobacter在适应酸性条件时，可能逐渐对更高浓度的乙酸产生耐受性[22]。窖池酒醅发酵中乙酸的含量位居各类酸类化合物中第二，而Acetobacter可在高含量乙酸的环境中实现相对丰度的增加，说明Acetobacter具有良好的耐乙酸特性。

2.3.2 基于属水平真菌群落动态变化

从1轮次酒醅中共检出69 个主要真菌属，2轮次酒醅中共检出58 个主要真菌属。1、2轮次真菌属多样性少于细菌属。如图6所示，随着发酵周期进行，真菌属多样性及其相对丰度呈现下降趋势，不仅酱香白酒发酵过程如此，在其他香型白酒发酵过程中也发现此趋势[23]。说明在白酒酿造窖池发酵中细菌占据发酵优势。1、2轮次酒醅中优势真菌属在上、中和底层的多样性及相对丰度差异比细菌属更大，可能是由于大多细菌为单细胞并具有鞭毛结构，可以在发酵过程中更加分散在空间各位置中[24]。

图6 1、2轮次窖池发酵酒醅真菌属相对丰度堆积柱状图Fig.6 Relative abundance of fungal genera in fermented grains in the first and second rounds of fermentation

1轮次酒醅中6 个优势真菌属，Saccharomyces是最主要的优势菌群，其不同空间的平均相对丰度分别为54.27%、54.27%和58.82%，其次是Torulaspora（32.48%、30.81%和32.50%）。此外，Paecilomyces、Saccharomycopsis、Monascus和Thermomyces也是优势菌属。王琳[25]从窖池酒醅中检出优势真菌属为Schizosaccharomyces、Saccharomyces、Zygosaccharomyces和Monascus等，与本研究检出优势真菌属一致，但上、中、底层优势真菌属结构及分布仍存在差异，且随着发酵时间的延长，微生物量下降，真菌在发酵后期检出量减少[26]。2轮次酒醅中共有8 个优势真菌属，主导优势菌属是Candida、Kazachstania和Saccharomyces。

由于酱香白酒属于半开放式发酵，Paecilomyces、Penicillium和Monascus等霉菌属可能来自酿造环境[27]。霉菌在1、2轮次酒醅上层占据优势，在中层和底层的多样性及平均相对丰度均有降低，而酵母属在底层占据优势，说明窖池底层环境的变化更适宜酵母菌生长，可能是因为酒醅底层的pH值较低，在酸性环境中酵母菌生长得更快[28]。这与之前研究中发现底层为更适宜酵母菌群生存的环境结果一致[14]。

2.4 1、2轮次窖池酒醅总酸及酸类化合物与微生物群落相关性

如图7a、b所示，Limosilactobacillus与总酸和酸类化合物（乳酸、乙酸、甲酸、草酸、柠檬酸和酒石酸）呈显著正相关（P＜0.05），说明除Lactobacillus产酸外，Limosilactobacillus也是发酵酒醅中产酸的主要优势细菌属[29]。Lactobacillus、Acetobacter、Lentilactobacillus、Lacti plantibacillus、Companilactobacillus、Ligilactobacillus、Levilactobacillus与酸类化合物呈负相关。一般而言，上述菌属产酸能力较强，但在本研究中发现它们与酸性物质呈现负相关。酱香白酒固态发酵过程属于酸性环境，随着酸类化合物的增加，pH值降低，菌群在长期（发酵时间30 d）酸胁迫的防御机制中，细胞内精氨酸脱亚胺酶和天冬氨酸的积累以及耐酸反应使细胞质pH值降低，进一步使其糖酵解酶的活性被破坏，进而造成大分子物质（DNA和蛋白质）的结构损伤[30]，导致其生物量降低。并且在酸性发酵酒醅中，这些菌群与其他微生物也存在生物学竞争，也会导致其产酸能力的减弱，从而降低代谢活性[31]。此外，耐酸特性及其性状也受到多个基因复杂的代谢网络调节[32]。这可能导致酸类化合物的积累，造成这些细菌属的生长受到抑制。Schizosaccharomyces、Zygosaccharomyces、Candida和Kazachstania与酸类化合物呈正相关，说明真菌属对酸类化合物的产生也有所贡献。例如，酵母可通过糖酵解途径分解糖类物质，生成酸类化合物如丙酮酸、琥珀酸[33]。但也存在少许真菌属Saccharomyces、Paecilomyces和Torulaspora与酸类化合物呈负相关。根据相关性分析的结果，可以初步推断1、2轮次酒醅中真菌群落促进酸类化合物的合成并使其抑制细菌群落的生长。有研究表明，高丰富度和多样性的真菌群落有利于有机酸的产生，而过高的细菌群落会使挥发性风味物质降低[34]，从而导致酱香型白酒的质量降低。

图7 酒醅中细菌和真菌与酸类化合物的相关性分析Fig.7 Correlation analysis of bacteria and fungi with acids in fermented grains

3 结论

酱香型白酒1轮次窖池发酵过程的总酸含量略低于2轮次，2 个轮次的总酸含量规律多为底层＞中层＞上层。从1、2轮次窖池酒醅中共检出7 种主要的酸类化合物，乳酸和乙酸含量始终保持优势占比，且不同时空窖池径向层面上酸类化合物存在显著差异。从酱香型白酒1轮次窖池发酵过程共检出150 个主要细菌属，69 个主要真菌属。上层优势细菌属为Limosilactobacillus、Lactobacillus、Acetobacter、Lentilactobacillus、Lacti ptibacillus、Companilactobacillus、Ligilactobacillus、Levilactobacillus；中层优势细菌属为Limosilactobacillus、Lactobacillus、Acetobacter、Lentilactobacillus、Lactiplantibacillus、Com panilactobacillus；底层优势细菌属为Limosilactobacillus、Lactobacillus、Acetobacter、Lentilactobacillus、Lactiplantibacillus、Ligilactobacillus，Limosilactobacillus占绝对主导地位。上层优势真菌属为Saccharomyces、Torulaspora、Paecilomyces、Saccharomycopsis、Monascus、Thermomyces；中层优势真菌属为Saccharomyces、Torulaspora、Paecilomyces、Monascus；底层优势真菌属为Saccha romyces、Torulaspora、Paecilomyces。从2轮次窖池发酵过程中共检出201 个主要细菌属，58 个主要真菌属。上层优势细菌属为Limosilactobacillus、Acetobacter、Virgibacillus、Lentilactobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus；中层优势细菌属为Limosilactobacillus、Acetobacter、Lactobacillus；底层优势细菌属为Limosilactobacillus、Aetobacter。上层优势真菌属为Candida、Kazachstania、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Thermomyces、Thermoascus和Saccharomycopsis；中层优势真菌属为Candida、Saccharomyces、Kazachstania、Schizosaccharomyces、Thermoascus、The rmomyces 和Penicillius；底层优势真菌属为Candida、Saccharomyces、Kazachstania、Schizosaccha romyces、Zygosaccha romyces、Penicillius、The rmoascus、The rmomyces和Saccharomycopsis。1、2轮次窖池发酵过程中微生物群系既存在相似性，同时差异性也较明显。

细菌属与大多酸类化合物（乳酸、乙酸、甲酸、草酸、柠檬酸和酒石酸）之间呈负相关，但Limosilactobacillus相对丰度与总酸和酸类化合物含量呈正相关。真菌属中Schizosaccharomyces、Zygosaccharomyces、Candida和Kazachstania相对丰度与酸类化合物含量呈正相关；Saccharomyces、Paecilomyces和Torulaspora相对丰度与酸类化合物含量呈负相关。此研究为酱香白酒窖池发酵不同时空径向的微生物群系与酸类化合物相关性作用机制的研究提供了进一步理论参考。