6 株鼠李糖乳杆菌的安全性评价

◆作者：张甜甜 林显华 吕文亮 徐海燕 王红 谷巍 王俊贤

◆单位：山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东省动物微生态制剂重点实验室

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）是一种乳酸杆菌，革兰氏阳性，无质粒，不能利用乳糖，可以代谢单糖。通常耐受胃肠道条件下的低pH 值、胆汁盐、厌氧环境（Riaz Rajoka M S 等，2017），已被证明对人体健康有多种益处，在食品、保健品和医药领域应用广泛。近年来越来越多的研究将鼠李糖乳杆菌应用于畜禽行业，刘耀东等（2021）的研究表明，鼠李糖乳杆菌微胶囊添加到日粮中可以提高仔猪生产性能和免疫力；鼠李糖乳杆菌53103 应用于断奶仔猪，可显著提高回肠黏膜sIgA 含量及血清中IgG、IgA 水平，可改善小肠和盲肠黏膜的微生物组成（耿婷婷等，2021）；鼠李糖乳杆菌MLGA可以通过提高血清中抗炎细胞因子水平以及降低促炎细胞因子的水平来抑制炎症反应的发生，从而降低免疫应激造成的炎症损伤（包龙飞，2019）；鼠李糖乳杆菌GR-1 可通过介导MAPK信号通路调节大肠杆菌诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤（刘佳玮，2022）。

鼠李糖乳杆菌已被美国食品和药物管理局授予“公认安全”地位，并被欧洲食品安全局列入“安全合格推定”名单，同时也是我国《可用于食品的菌种名单》之一。尽管有众多的证据表明鼠李糖乳杆菌物种的总体安全性，但它们也可能造成不良反应（Chiang M C 等，2021）。因此，在使用乳酸杆菌前，需要进行菌株安全性评价。本研究以6 株鼠李糖乳杆菌为研究对象，进行溶血性、有害代谢产物产生、药物敏感性、抑菌性能、小鼠急性毒性试验，为乳酸杆菌株的进一步应用提供理论依据。

1 实验材料

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

鼠李糖乳杆菌BLCC2-0463、0465、0466、0467、0470、0479，由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物工程研究院菌种保藏中心提供。

1.1.2 试验动物

昆明白鼠购买自济南朋悦实验动物繁育有限公司。

1.1.3 培养基

硝酸盐肉汤、氨基酸脱羧酶肉汤、蛋白胨水等生化管和血琼脂平板、MRS 肉汤培养基、MRS琼脂培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.1.4 试剂

红霉素、氯霉素购买自中国食品药品检定研究院，克林霉素、庆大霉素、卡那霉素、四环素购买自中国兽药监察所，氨苄西林、链霉素购买自SIGMA，猪胆盐购买自源叶生物，D- 乳酸试剂盒购买自上海酶联生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

酶标仪（Tecan F50），瑞士Tecan 公 司； 超 净 工 作 台（SW-CJ-1F），上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；电热恒温培养箱（DHP-9082），上海一恒科学仪器有限公司；雷磁pH 计（PHS-3D），上海仪电科学仪器股份有限公司；高速离心机（Thermo Fisher），赛默飞世尔科技公司。

2 实验方法

2.1 乳杆菌的活化

取冻存菌种，接种至MRS斜面培养基37 ℃培养48 h 进行活化，反复活化两次，放置4 ℃冰箱备用。

2.2 溶血性测定

参考Garcia（2017）的方法，将活化好的菌株使用无菌棉签划线接种至血琼脂平板上，于37℃恒温培养48 h。长出的菌落周围出现透明圈表示该菌株具有β-溶血性，可能具有致病性。

2.3 有害代谢产物的检测

取活化菌接种于MRS 液体培养基中，37℃培养16～18h，备用。

使用D-乳酸试剂盒检测乳杆菌发酵液D-乳酸的浓度。

取发酵液离心获得菌体，用PBS 重悬，稀释1000 倍，制成菌悬液待用；吸取50μL 菌悬液分别加入硝酸盐肉汤、氨基酸脱羧酶对照、赖氨酸脱羧酶肉汤、鸟氨酸脱羧酶肉汤、蛋白胨水中，37 ℃培养。氨基酸脱羧酶试验以鼠伤寒沙门氏菌作为对照。

2.4 抗生素敏感性的测定

依据美国临床试验室标准化委员会（M7-A 72006）以及国际标准化组织（ISO 10932/IDF223）发布的标准方法，选择红霉素、氯霉素、氨苄西林、克林霉素、庆大霉素、卡那霉素、四环素、链霉素等进行菌株抗生素敏感性试验。鼠李糖乳杆菌不同抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）如表1 所示（农办牧[2021]43 号）。

2.5 小鼠急性毒性试验

调节鼠李糖乳杆菌菌悬液浓度为1×1010CFU/mL。选取70只健康雄性昆明雄鼠，随机均分为7 组，试验组小鼠每天灌服0.2 mL 活菌含量为1 ×1010CFU/mL 鼠李糖乳杆菌活菌液，对照组小鼠每天灌服等量的无菌生理盐水；连续7 d，每天记录小鼠生长情况，7 d 后剖解，观察小鼠内脏器官是否出现病变。

2.6 乳酸菌对指示菌抑菌活性的测定

将已活化的产气荚膜梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌菌悬液加入到已灭菌并冷却至40～50 ℃的TSA 平板计数培养基中（使指示菌的浓度保持1×106CFU/mL），摇匀后迅速加入平板中，每平板15 mL。待平板凝固后，在平板上均匀打孔，孔径7 mm，每孔分别加入各株试验菌发酵液50μL，37 ℃培养24 h，测定抑菌圈直径大小。

3 结果与讨论

3.1 鼠李糖乳杆菌溶血性分析

溶血能力是乳酸菌属安全性评价的重要筛选标准之一（李国花，2023）；微生物的溶血类型包括α-溶血、β-溶血、γ-溶血三种，其中α- 溶血（菌落周围出现草绿色）和γ- 溶血（菌落周围无草绿色无透明圈）均无致病性，仅β-溶血（菌落周围出现透明圈）与致病性有关。

6 株鼠李糖乳杆菌在血琼脂平板划线培养48 h 均未产生溶血环，说明6 株鼠李糖乳杆菌不具有溶血活性，是较安全的菌株。

3.2 有害代谢产物检测结果

生物胺是世界范围内公认的影响人体健康的物质（何一龙等，2020），因此，有必要对生物胺的产生进行研究。具有硝酸还原酶的菌株，能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，具有致癌风险，危害健康（凌宇恒等，2017）；色氨酸为人体必需氨基酸，参与人体蛋白质的合成，调节免疫功能，吲哚试验可检测菌株是否能分解蛋白质中的色氨酸（王梦姣等，2014）。本研究中6 株鼠李糖乳杆菌有害代谢产物结果见表2，精氨酸、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、硝酸盐还原、吲哚试验均为阴性，说明试验菌株不会将赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸和精氨酸分解成尸胺、腐胺和精胺，不会将硝酸盐还原为亚硝酸盐，不产生吲哚。乳酸菌发酵后产生的乳酸分为D-乳酸和L-乳酸，人体只具有代谢L- 乳酸的能力，过量的D-乳酸可能引起代谢紊乱甚至中毒（王梦姣等，2014）。试验中的6 株乳杆菌均可产生少量的D-乳酸，D-乳酸含量均低于0.06μmol/mL，其中0479 产D-乳酸最少，为0.0395μmol/mL。

表2 有害代谢产物试验结果

3.3 抗生素敏感性的测定

研究表明，细菌耐药性基因能在微生物菌群间相互传递，而使某种病原菌获得耐药性，因此菌株耐药性的安全问题受到极大关注。鼠李糖乳杆菌XX-11（邹文政等，2020）对呋喃唑酮、磺胺甲唑与诺氟沙星有一定程度的耐药性，而对青霉素、氯霉素、庆大霉素、四环素、链霉素与红霉素等药物表现敏感。何亚婷等（2015）从鲫鱼分离出来的鼠李糖乳杆菌对四环素与红霉素耐药。本研究将试验菌株MIC 值（见表3）与鼠李糖乳杆菌对不同抗生素的临界值（见表1）对比，若试验菌株MIC 值小于或等于临界值为敏感；大于临界值为不敏 感。结 果 显 示，0463、0465、0479 对红霉素、氯霉素、氨苄西林、克林霉素、庆大霉素、卡那霉素、四环素、链霉素均表现出敏感性，0466 对氨苄西林耐药，0467、0470 对氯霉素、氨苄西林耐药，这表明不同鼠李糖乳杆菌对药物的敏感性差异较大。

表3 菌株抗生素敏感性试验结果

3.4 乳酸菌对指示菌抑菌活性的测定

有研究表明鼠李糖乳杆菌能产生对病原菌具有抑制作用的细菌素。邹文政等（2020）研究表明，鼠李糖乳杆菌XX-11 培养上清液对大肠杆菌等10 株指示菌抑菌圈直径在15 mm 以上；周鲜娇（2014）等分离的7 株鼠李糖乳杆菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在2～3 cm。由表4 可以看出，本研究6株鼠李糖乳杆菌都对四种病原菌有一定的抑制作用，抑菌圈直径在9.75 mm 以上，抑菌圈直径小于文献中的原因可能是试验方法的差异造成的。

表4 抑菌性能结果

3.5 小鼠急性毒性试验结果

观察期间对照组与6 个试验组小鼠均无异常表现、无死亡，精神状态良好，粪便形态无明显差异，体重正常增长，剖检观察未见任何器官、消化道病变，表明6 株鼠李糖乳杆菌对小鼠安全、无毒副作用。

4 结论

对实验室保存的6 株鼠李糖乳杆菌进行溶血性、有害代谢产物、抗生素耐受性、小鼠安全性和抑菌性能试验，试验结果显示，所选用的6 株鼠李糖乳杆菌均无溶血活性，不产生氨基酸脱羧酶和吲哚，不能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，会产生少量的D-乳酸，均低于0.0600μmol/mL，其中0479 产D- 乳酸最少，为0.0395μmol/mL；0463、0465、0479菌株对所测试抗生素均敏感；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的抑菌圈直径在9.75 mm 以上；对小鼠未造成不良反应。综上所述，测试的6 株鼠李糖乳杆菌具有较强的安全性，且对常见肠道致病菌具有一定的抑制能力，具有较好的应用潜能。

参考文献：（略）