黄芩汤治疗蓖麻油致小鼠腹泻的作用及机制研究

陈文露 ，彭新宇，康桦华，潘育方，唐兴刚，蒋顺进，黄炜乾，丁焕中，黄 婷 ，徐志宏

1.广东省农业科学院动物卫生研究所，广东 广州 510640

2.惠东县人民医院，广东 惠州 516399

3.广东药科大学，广东 广州 510006

4.广东容大生物股份有限公司，广东 清远 511517

5.华南农业大学，广东 广州 510642

6.仲恺农业工程学院 动物科技学院，广东 广州 510225

腹泻是指大便频次增多，粪便呈半流质或水样，伴有腹部胀满、腹痛等症状的一种消化系统疾病[1]。急性腹泻在发展中国家仍与发病率和死亡率增加有关，而用于治疗腹泻的抗生素常导致耐药性和菌群失调，因此，由于中药止泻具有较低的不良反应和良好的功效，越来越受到研究者的关注。

目前，腹泻模型有细菌[2]、降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）[3]、脂多糖[4]和蓖麻油[4]诱导的腹泻模型。研究表明，水通道蛋白（aquaporins，AQPs）、Na/H 离子交换器（Na/H exchangers，NHEs）和急性期蛋白（acute phase proteins，APPs）的水平与蓖麻油致腹泻相关，肠道的关键功能是吸收水分[5]，APPs 控制肠道内的跨上皮液运输[6]。AQP3 和AQP4 在小鼠肠道内定位，在腹泻时下调[7-9]，可能影响水分吸收。目前已知10 种哺乳动物NHEs 亚型，其中NHE1、NHE2、NHE3和NHE8 在肠上皮[10]中已被鉴定，均在细胞膜刷缘区高表达[11]，NHE3 为主要亚型[12]。NHE3 缺陷小鼠Na+吸收缺陷，酸碱失衡[13]，导致自发性轻度腹泻和酸中毒[14]。NHE8 对Na+吸收也至关重要[15]，可以维持肠内的黏膜稳态[16]。NHE2 的破坏改变了黏液层的酸性分泌，减少肠壁和原酶细胞的数量，影响肠道屏障恢复[17]。包括α-1-酸性糖蛋白（α-1-acid glycoprotein，AGP）、转铁蛋白（transferrin，TRF）、白蛋白（albumin，ALB）和、C 反应蛋白（Creactive protein，CRP）在内的APPs 主要由肝细胞合成，是创伤、感染、应激、肿瘤和炎症所触发的先天急性期反应的一部分[18-19]。

肠道菌群是一个密集多样的生态系统，涉及生理和病理过程。一方面，正常的肠道菌群通过帮助新陈代谢、排除毒素和维持肠道屏障功能来影响宿主的健康。另一方面，肠道菌群失调涉及多种疾病和炎症反应[20-28]。黄芩汤由黄芩、芍药、甘草和红枣组成[29]，最早出现在中医论著《伤寒论》中，主要用于治疗胃肠道疾病如腹泻、腹部痉挛、发热、头痛、呕吐、恶心、极度口渴、心脏下胀等。多年的临床治疗经验表明，黄芩汤治疗胃肠道疾病安全有效。研究发现，黄芩汤可减少癌症治疗相关的毒性的影响[30-31]，可以通过激活Wnt 通路来修复损伤肠道上皮细胞，并通过下调诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）缓解炎症[27]。然而，黄芩汤的止泻机制尚不明确。因此，本研究从肠道菌群、APPs、AQPs、NHEs 的肠道表达等方面评价了黄芩汤对蓖麻油致腹泻的影响。

1 材料

1.1 动物

SPF 级昆明小鼠60 只，雌雄各半，3～4 周龄，体质量18～20 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号SCXK（鲁）20140007。动物在温度（23.0±1.5）℃、相对湿度（50±15）%环境下饲养。动物实验经广东省农业科学院动物卫生研究所动物伦理委员会批准（批准号20180107003）。

1.2 药材

黄芩、芍药、甘草和红枣（批号分别为20170911、20180506、20180620、20180523）购自广东省广州市大参林药店，经广东药科大学中医学院程轩轩教授分别鉴定为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi 的干燥根、毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎、鼠李科植物枣ZiziphusjujubaMill.的干燥成熟果实。

1.3 药品与试剂

对照品黄芩苷（批号P16S8F44143）、黄芩素（批号CO2A6Y1）、汉黄芩苷（批号P09J8F28374）购自上海源叶生物技术有限公司，质量分数均≥98%；对照品芍药苷（批号17031901，质量分数为99.3%）、甘草酸铵（批号17060510，质量分数为99.45%）购自北京恒元启天化工技术研究院；盐酸洛哌丁胺胶囊（批号20170820）购自西安杨森制药有限公司；蓖麻油（批号151111）购自湖北科田药业有限公司；中性通用型组织固定液（批号YP184305）、Trizol 溶液（批号182805）、HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗（批号GB23303）购自武汉塞维尔生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（批号10247）购自日本TaKaRa 公司；RNase-Free Water（批号EC05BA0039）购自上海生工生物工程技术服务有限公司；NHE8 兔抗（批号24K4519）购自Affinity 公司；APQ3 兔抗（批号CPA4133）购自Cohesion Biosciences 公司；GAPDH小鼠单抗（批号KC-5G4）购自上海康成生物工程有限公司；HRP 标记的羊抗小鼠IgG 二抗（批号BA1050）购自武汉博士德生物工程有限公司；DNA抽提试剂盒（批号CLS-D6382-01）购自美国Bio Tek公司。

1.4 仪器

Agilent 1260 型超高液相色谱仪（美国Agilent公司）；XS 型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DS-FI2 型显微镜（日本Nikon 公司）；Epoch 2 型超微量分光光度计、EL800 型酶标仪（美国Bio Tek 公司）；TBS380 型微型荧光计（美国Turner Biosystems 公司）；Light Cycle 480 型高通量实时荧光定量PCR 仪（瑞士罗氏公司）；5418 型高速离心机（德国Eppendorf 公司）；DW-86W420 型低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）；HISEQ 型测序仪（美国Illumina 公司）。

2 方法

2.1 黄芩汤制备和质量控制

2.1.1 黄芩汤的制备 经UPLC 检测本研究所用药材黄芩中黄芩苷质量分数为13.19%，白芍中芍药苷质量分数为3.1%，甘草中甘草酸铵质量分数为2.29%，符合《中国药典》2020 年版规定。称取黄芩90 g、芍药60 g、甘草60 g、红枣60 g，加入15倍量的水煮沸2 h，滤过；残渣再加入10 倍量的水煮沸提取1 h，滤过。合并2 次提取液，浓缩至1 g/mL，冷却至4 ℃。

2.1.2 黄芩汤的质量控制

（1）对照品溶液的制备：分别称定芍药苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和甘草酸铵0.020 5、0.020 5、0.010 0、0.010 1、0.010 3 g 于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解即得对照品储备液。取对照品储备液，稀释制备系列梯度质量浓度的对照品溶液，芍药苷质量浓度为40、60、80、100、120 mg/mL，黄芩苷质量浓度为120、140、160、200、220 mg/mL；黄芩素质量浓度为10、30、50、70、90 mg/mL，汉黄芩苷质量浓度为8、10、20、40、80 mg/mL，甘草酸铵质量浓度为20、40、60、80、100 mg/mL。

（2）色谱条件：Poroshell 120 EC-C18色谱柱（100 mm×3 mm，2.7 μm），流动相为0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～4 min，90% A；4～5 min，90%～80% A；5～15 min，80%～50% A；15～16 min，50%～0 A；16～17 min，0～90% A。体积流量0.6 mL/min；柱温40 ℃；检测波长230 nm。

（3）样品检测：黄芩汤提取物用蒸馏水稀释至0.02 g/mL，经0.22 μm 膜滤过，按照色谱条件进样检测。

2.2 分组、造模及给药

小鼠适应性饲养7 d 后，随机分为对照组、模型组、洛哌丁胺（5 mg/kg）组和黄芩汤高、中、低剂量（20、10、5 g/kg）组，每组10 只。给药组ig相应药物，对照组和模型组ig 等体积的生理盐水，1 次/d，连续3 d。第2 天晚上给药后小鼠禁食不禁水，第3 天给药30 min 后，除对照组外其余小鼠ig 0.5 mL 蓖麻油制备腹泻模型。

2.3 腹泻评分和腹泻指数的测定

造模后，将小鼠放在不同的笼子里（每笼1 只），在滤纸上收集粪便，计算腹泻评分和腹泻指数。腹泻评分：正常便0 分，半固体便2 分，水样便3 分。稀便等级：稀便直径小于1 cm 为1 级，直径为1.0～1.9 cm 为2 级，直径为2.0～3.0 cm 为3 级，直径＞3.0 cm 为4 级。

稀便率＝小鼠稀便次数/小鼠总排便次数

稀便级数＝稀便等级数之和/稀便次数

腹泻指数＝稀便率×稀便级数

2.4 qRT-PCR 检测肝脏AGP、ALB、TRF、CRP和小肠NHE2、NHE3、NHE8、AQP3、AQP4 基因表达

造模4 h 后小鼠安乐死，取小鼠肝脏和小肠。按照试剂盒说明书提取总RNA 并合成cDNA，进行qRT-PCR 分析。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.5 免疫组化检测小肠NHE8 和AQP3 蛋白表达

取各组小肠组织，于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切成4 µm 切片。3%牛血清白蛋白封闭后，滴加AQP3（1∶800）、NHE8（1∶100）抗体孵育，PBS 洗涤后，滴加二抗室温孵育5 min，DAB 显色、示苏木素染色后，脱水、透明、封片，于显微镜下观察并拍照。

2.6 Western blotting 检测小肠NHE8 和AQP3 蛋白表达

取各组小肠组织，剪碎后加入RIPA 裂解液提取蛋白。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，于5%脱脂牛奶中封闭，分别加入NHE8、AQP3 抗体孵育，洗涤后加入二抗孵育，用全自动凝胶成像分析系统采集条带。

2.7 16S rRNA 基因测序

2.7.1 16S rRNA 的提取和扩增 取各组小肠组织，根据E.Z.N.A.®soil 试剂盒说明书进行总DNA 抽提，用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）对V3～V4 可变区进行PCR 扩增，扩增程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s（27 个循环），72 ℃延伸10 min。

2.7.2 Illumina Miseq 测序 采用2%琼脂糖凝胶电泳回收PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction试剂盒对产物进行纯化，Tris-HCl 洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用微量荧光计进行定量分析。根据Illumina MiSeq 平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2*300 的文库。构建文库步骤：（1）连接“Y”字形接头；（2）使用磁珠筛选去除接头自连片段；（3）利用PCR 扩增进行文库模板的富集；（4）氢氧化钠变性，产生单链DNA 片段。送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序分析。

2.8 统计学分析

采用Spass 23 软件进行统计分析，组间差异比较用单因素方差（One-way ANOVE）分析，采用GraphPad Prism 7 软件作图。

3 结果

3.1 黄芩汤的成分分析

以芍药苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、甘草酸铵为对照品，采用UPLC 对黄芩汤的成分进行分析。对照品和黄芩汤样品的色谱图见图1，峰面积（Y）与质量浓度（X）呈线性关系（表2），表明芍药苷、黄芩苷、黄芩素、黄芩苷、甘草酸铵在各自的质量浓度范围内线性关系良好。作为黄芩汤的主要成分，芍药苷来源于芍药，而黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷来源于黄芩，甘草酸铵来源于甘草。1 kg黄芩汤药材可提取干燥成93 g 提取物粉末，芍药苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和甘草酸铵质量浓度分别为100.32、186.51、69.89、25.05、61.26 µg/mL。

图1 对照品 (A) 和黄芩汤 (B) 的UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of reference substance (A)and Huangqin Decoction (B)

表2 各成分的回归方程、线性范围和相关系数Table 2 Regression equations, linear ranges and correlation coefficients for each component

3.2 黄芩汤对腹泻小鼠腹泻指数和腹泻评分的影响

如图2 所示，与对照组比较，模型组小鼠腹泻指数和腹泻评分明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组小鼠腹泻指数和腹泻评分均显著降低（P＜0.05）。

图2 黄芩汤对腹泻小鼠腹泻指数和腹泻评分的影响 (±s , n = 5)Fig.2 Effect of Huangqin Decoction on diarrhea index and diarrhea score in diarrhea mice (±s , n = 5)

3.3 黄芩汤对腹泻小鼠肝脏AGP、ALB、TRF、CRP和小肠NHE2、NHE3、NHE8、AQP3、AQP4 基因表达的影响

如图3 所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏中CRP和AGPmRNA 表达水平明显升高（P＜0.05），TRFmRNA 表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，黄芩汤低剂量组CRPmRNA 表达水平显著降低（P＜0.05），洛哌丁胺组和黄芩汤中、高剂量组AGPmRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）。

图3 黄芩汤对腹泻小鼠肝脏CRP、AGP、ALB 和TRF 基因表达的影响 (±s, n = 5)Fig.3 Effect of Huangqin Decoction on CRP, AGP, ALB and TRF gene expressions in liver of diarrhea mice (±s , n = 5)

如图4 所示，与对照组比较，模型组小鼠小肠中AQP3、NHE3和NHE8mRNA 表达水平均明显升高（P＜0.05），AQP4mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，洛哌丁胺组和黄芩汤中、高剂量组AQP3mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）。黄芩汤各剂量组NHE8mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）。

3.4 黄芩汤对腹泻小鼠小肠AQP 和NHE83 蛋白表达的影响

如图5 所示，免疫组化验证了AQP3 和NHE8在肠道的特异性定位表达。如图6 所示，与对照组比较，模型组AQP3 和NHE8 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组AQP3 和NHE8 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），与“2.3”项下结果一致。

图5 免疫组化检测AQP3 和NHE8 在小肠上皮细胞绒毛中的定位Fig.5 Localization of AQP3 (A) and NHE8 (B) in villi of small intestinal epithelial cells by immunohistochemistry

图6 Western blotting 检测小肠AQP3 和NHE8 蛋白表达 (±s, n = 5)Fig.6 AQP3 and NHE8 protein expressions in small intestine by Western blotting (±s , n = 5)

3.5 黄芩汤对腹泻小鼠肠道菌群的调节作用

采用Shannon 指数和ACE 指数测定肠道菌群α 多样性（均匀度和丰富度）。如图7 所示，黄芩汤低、高剂量组Shannon 指数显著低于对照组（P＜0.05）。各组ACE 指数无显著差异。主坐标分析结果（图8）显示，黄芩汤各剂量组与模型组、对照组差异显著，而洛哌丁胺组与模型组相似。

图7 各组肠道菌群的α 多样性 (±s, n = 5)Fig.7 Alpha diversity of gut microbiota in each group (±s, n = 5)

图8 各组小鼠肠道菌群的主坐标分析Fig.8 Principal co-ordinates analysis of gut microbiota in each group of mice

如图9-A 所示，各组小鼠肠道菌群优势菌门为变形杆菌门（ Proteobacteria ）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）。与模型组比较，黄芩汤各剂量组和洛哌丁胺组厚壁菌门丰度降低，黄芩汤高剂量组和洛哌丁胺组放线菌门丰度降低，黄芩汤中、低剂量组放线菌门丰度升高，黄芩汤低、高剂量组和洛哌丁胺组厚壁菌门与拟杆菌门比值（F/B）降低。

图9 各组小鼠门 (A) 和属 (B) 水平肠道菌群丰度 (±s, n = 5)Fig.9 Abundance of gut microbiota at phylum (A) and genus (B) levels in each group of mice (±s , n = 5)

如图9-B 所示，各组小鼠肠道菌群优势菌属为Candidatus_Arthromitus、乳杆菌属Lactobacillus、粪杆 菌 属Faecalibaculum、棒 状 杆 菌 属Corynebacterium_1、双歧杆菌属Bifidobacterium、螺杆菌属Helicobacter和气球菌属Aerococcus。与模型组比较，各给药组双歧杆菌属、粪杆菌属和Ruminococcaceae_UCG-014 丰度降低；黄芩汤低剂量组Facklamia、Jeotgalicoccus和Corynebacterium_1 丰度升高，乳杆菌属和unclassified_p_Firmicutes丰度降低；黄芩汤高剂量组 unclassified_p_Firmicutes 和Candidatus_Arthromitus丰度升高；黄芩汤中剂量组 unclassified_p_Firmicutes 和Psychrobacter丰度升高。

4 讨论

蓖麻油及其活性成分蓖麻油酸能够降低小肠和结肠对Na+和K+的吸收，降低Na+、K+ATP 酶活性，改变肠道通透性，从而引起小鼠腹泻[32]，同时会伴随肠绒毛大量坏死、脱落，杯状细胞生成量减少，随着内层黏液消耗殆尽抗菌屏障被破坏，小鼠肠道菌群稳态被破坏[33]。蓖麻油腹泻模型模拟了小鼠在经过肠炎腹泻中的生理变化，有利于研究黄芩汤在炎症腹泻过程中药理作用研究。

本研究发现，黄芩汤可通过调节小鼠小肠内Na+/H+交换剂和水通道蛋白来缓解小鼠腹泻。黄芩汤下调上皮细胞AQP3和NHE8的mRNA 和蛋白表达，下调急性期蛋白AGPs、CRP的mRNA 表达。与对照组比较，模型组AQP4和TRFmRNA 表达水平明显降低，NHE3mRNA 表达水平明显升高，但黄芩汤对AQP4、TRF、NHE3mRNA 表达均无明显调节作用，这可能由于腹泻诱导和组织剥离之间的时间窗太短。

通过16S rRNA 基因测序发现，蓖麻油诱导的腹泻小鼠肠道菌群显著改变，这可能作为肠道健康的潜在生物标志物。而黄芩汤部分逆转了这一改变。厚壁菌门和拟杆菌门是主要的肠道菌群门，可以调节宿主炎症和免疫状态[34]。厚壁菌门是宿主代谢的关键因素[35]，但其在肠道内的过度生长会导致脂多糖等代谢内毒素的产生，这些内毒素会进入血流，引发炎症[36]。而拟杆菌门则减少了肠道和全身的炎症反应[37-38]。因此，F/B 值升高提示自身免疫性疾病具有促炎环境和免疫失衡的特征。蓖麻油升高F/B 值，洛哌丁胺和黄芩汤有降低F/B 值的作用。

黄芩汤显著降低粪杆菌属的相对丰度[39-41]。本研究结果显示，黄芩汤降低双歧杆菌属、粪杆菌属、Ruminococcaceae_UCG-014 和 unclassified_p_Firmicutes 的相对丰度，影响了小肠微生物群的组成。双歧杆菌是人类胃肠道的主要有益共生体[42]，Ruminococcaceae_UCG-014 通过分泌大量的复合酶帮助机体消化吸收纤维素的能量[43]。在黄芩汤高剂量组中，具有调节宿主免疫系统的Candidatus_Arthromitus的相对丰度增加[44]，而在黄芩汤中、低剂量组中未发现这种现象。黄芩汤低剂量组Facklamia、Jeotgalicoccus和Corynebacterium_1 的相对丰度增加，黄芩汤中剂量组Psychrobacter的相对丰度增加。Jeotgalicoccus对人体健康有着至关重要的作用，可能是肠道菌群的核心功能群之一[45]。Facklamia、Corynebacterium_1 和Psychrobacter在以往研究[46-49]中均有提及，但未对其在腹泻模型中的作用进行解释。因此，这些菌群的改变与黄芩汤抗腹泻作用的关系尚不清楚。基于以上结果，推测黄芩汤可能通过降低双歧杆菌属和Ruminococcaceae_UCG-014 的相对丰度，并增加Candidatus_Arthromitus和Jeotgalicoccus的相对丰度，从而平衡小鼠的肠道健康。本研究结果为腹泻的分子机制和肠道菌群的研究提供了新的思路，为黄芩汤的临床应用提供了实验依据。然而，临床腹泻的发病机制复杂，黄芩汤的作用机制需要在不同病因的腹泻模型中进行验证分析。

综上，在蓖麻油致腹泻模型中，黄芩汤具有明显的止泻作用。可以通过降低AQP3和NHE8的mRNA 和蛋白表达，降低肠道菌群F/B 值，来缓解腹泻症状。本研究揭示了黄芩汤在微生态系统中的其他变化，如高剂量黄芩汤增加了Candidatus_Arthromitus的相对丰度，这与肠上皮的免疫活性有关。低剂量黄芩汤增加了Jeotgalicoccus的相对丰度，对肠道健康起着重要的作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突