宏基因组二代测序诊断急性Q热并脑膜脑炎1例*

杨敏,马晶,杨舒婷,黄国虹,王昌敏(新疆维吾尔自治区人民医院临床检验中心,乌鲁木齐 830001)

Q热(Q Fever)是一种由贝纳特柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)引起的人畜共患病,人类Q热的感染源主要是家畜(尤其是牛、羊)。该病原体以蜱为传播媒介进行传播并可以在动物体内经卵传代,从而形成自然疫源地[1]。流行病学数据显示,该病人群总体患病率为10.2%(1 139/11 209)[2]。Cb在常规血培养中不生长,实验室检查方法主要为血清学检测、PCR检测、病原培养等[3]。目前我院尚未常规开展上述项目,当临床出现相关病例时,极易被忽视,误诊率和漏诊率较高。本研究通过采用宏基因组二代测序(metagenomic next generation sequencing,mNGS)技术辅助诊断急性Q热并脑膜脑炎1例,报道如下。

1 病历资料

患者男,28岁,无业,因“发热5 d”于2022年6月27日就诊于新疆维吾尔自治区人民医院(以下简称“我院”)。患者5 d前高温劳作后出现头痛、发热,体温最高39 ℃,自行口服抗生素后,头痛缓解,但仍有发热、乏力,伴恶心、呕吐1次,呕吐物为胃内容物,有腹胀、纳差,否认腹痛、腹泻,发热病区以“发热待查”收治入院。患者平素体健,既往有神经性皮炎病史,家族史、婚育史均无特殊,否认近期疫区流行病学史及牲畜接触史。入院查体:体温38.2 ℃;脉搏104次/分;呼吸23次/分;血压128/96 mmHg,心肺未见明显异常,神经系统查体未见明显阳性体征。血常规示:白细胞7.01×109/L,中性粒细胞百分比76.70%,C反应蛋白72.93 mg/L;血沉28.00 mm/h;肝功能指标结果:丙氨酸氨基转移酶(ALT)75.00 U/L、天冬氨酸氨基转移酶(AST)60.00 U/L、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)160.00 U/L。肺部CT未见明显异常,头颅MR示双侧软脑膜可疑强化,其余检查无特殊。入院次日患者突发谵妄并出现自杀行为,送检外周血及脑脊液mNGS检测后提示Cb感染,经规范化治疗后患者病情明显好转,未再发热,未再出现谵妄、神经症状,复查肝功能指标较前有所下降,无特殊不适主诉,故于2022年7月14日出院,院外继续口服多西环素片21 d、口服保肝药物,监测肝功能,定期复查。

2 实验室检查方法及结果

2.1标本采集及前处理

2.1.1外周血采集及前处理 在患者接受抗生素治疗前采血,并尽可能在寒战或开始发热时采血。选择游离DNA保存管或EDTA-K2抗凝管,随机采集患者静脉血3～5 mL,抽血时避免溶血。采血后立即轻轻颠倒混匀8～10 次,避免凝固,混匀时动作不能太剧烈,防止溶血。8 h内将采血管置于4 ℃、4 000 r/min离心10 min,取300 μL血浆,使用核酸提取或纯化试剂盒(武汉华大生物科技有限公司)进行血浆DNA提取。

2.1.2脑脊液采集及前处理 征得患者同意后,由临床医师采集脑脊液2 mL,立即送检。取600 μL脑脊液加入7.2 μL溶壁酶进行酶破壁反应,在0.5 mm玻璃珠(250 μL)中进行物理破壁,混合震荡20 min后收集300 μL样本,使用核酸提取或纯化试剂盒(武汉华大生物科技有限公司)进行脑脊液DNA提取,检测浓度后使用基因组DNA片段化试剂盒(武汉华大生物科技有限公司)进行酶切反应,酶切产物备用。其余样本置于-70 ℃储存6个月以备复查,应避免反复冻融。

2.2mNGS检测及结果 将以上两种标本同时进行下述检测流程,按照DNA核酸检测试剂盒(武汉华大生物科技有限公司)说明书设置合适的温度和循环数进行末端修复(37 ℃ 10 min;65 ℃15 min)、接头连接(23 ℃ 20 min)、PCR扩增(98 ℃ 2 min; 98 ℃ 15 s,56 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共12个循环;72 ℃ 5 min)、纯化等一系列步骤,使用Qubit 4荧光仪及Qubit ds DNA HS Assay Kit(美国赛默飞世尔科技有限公司)检测PCR纯化产物(即文库)的浓度。按照检测后的PCR浓度将构建好的文库按等质量进行pooling,将pooling混合后的文库经环化形成单链环形结构,再经滚环复制生成DNB纳米球。制备好的DNB纳米球加载至测序芯片,使用MGISEQ-2000基因测序仪(武汉华大智造科技有限公司)进行测序[4]。测序数据下机后去除低质量的序列以获得高质量的数据。通过BWA软件比对将高质量数据中比对上人参考基因组序列的数据去除[5]。剩下的数据在去除低复杂度序列后与武汉华大生物科技有限公司自主研发的PMDB病原数据库(包括6 350种细菌、1 064种真菌、4 945种病毒、234种寄生虫)进行比对,获得病原微生物的鉴定结果,并自动生成检测报告及各类病原体检出列表。

7月3日,患者血浆mNGS报告检出Cb,严格比对序列数14,相对丰度36.56%,覆盖率0.027 1%,基因组覆盖分布图见图1。患者脑脊液mNGS报告未检出任何病原体。

注:覆盖率,检测到的该菌核酸序列长度占该菌整个基因组序列长度的百分比;横坐标为检测到的该菌核酸序列在该菌整个基因组上的位置;纵坐标为每个位置上检出该菌的序列数。图1 Cb的基因组覆盖分布情况

3 讨论

针对发热待查患者的诊断,检验科一直以来都扮演着非常重要的角色,从最基础的血尿便常规检查、生化检测、微生物培养、分子检测,到近年来应用广泛的宏基因组二代测序技术[6],均为临床的诊断提供了许多线索。在本案例中,患者为青年男性,急性起病,高热不退,完善相关检查后,自身免疫病、肿瘤性疾病、血液系统疾病诊断依据不足,遂考虑感染性疾病可能性大。患者既往无神经系统器质性问题、器质性精神障碍等病史,病程中突发谵妄并出现自杀行为,考虑中枢神经系统感染。常规实验室检查均未明确感染源,患者病情重且进展快,故而送检外周血及脑脊液进行宏基因组二代测序。

本次研究在血浆中检出Cb序列14条,样本建库浓度合格,且在基因组覆盖分布图上可看到序列分布比较分散,代表Cb整个基因组不同位置均检测到有效序列;此外,回看检出的其他微生物列表,均为背景菌或定植菌,未关注到其他可疑致病菌,结果较为可信。脑脊液mNGS结果报告为阴性。将结果反馈给临床后,医生追问患者病史,患者在乌鲁木齐市南山居住长达1年,该地山林环绕,存在大量蜱虫,不排除患者被叮咬或接触含Cb气溶胶的可能,为Q热易感人群,结合患者流行病学史、临床症状、体征及二代测序检测结果,考虑诊断为急性Q热。病程中患者出现中枢神经系统症状,头颅MRI软脑膜可疑强化,存在脑膜脑炎,虽脑脊液二代测序未检出有效序列,但患者用药后症状明显改善,神志转清,精神好转,仍考虑为Q热所致无菌性脑膜脑炎。

综上所述,本研究通过mNGS辅助诊断了1例急性Q热伴脑膜脑炎的患者,提示当临床出现不明原因发热的患者,且常规检验未能明确感染源时,可考虑行二代测序进行辅助诊断,为临床医生在缺乏有效诊断依据时提供新思路;对于高热伴肝酶异常、出现神经症状的患者,常规抗感染、抗病毒治疗无效时,不应忽视Q热的筛查。