鸡蛋过敏患儿蛋清4种组分sIgE抗体分布特征*

孙瑗敏,谭欣,郑力胜,张蓓,杨小慧,于洋,李会强(.天津医科大学医学检验学院,天津 30003;.天津市儿童医院检验科,天津 300074)

鸡蛋是婴幼儿最早摄入的食物之一,鸡蛋过敏(egg allergy,EA)是全球婴幼儿及儿童最常见的一种食物过敏现象[1]。据估计,5岁以下儿童的鸡蛋过敏患病率在1.8%～2%之间,鸡蛋过敏儿童最常见的症状是由IgE介导的变态反应所致,在极少数的情况下,患者也会因鸡蛋过敏而引起致命的反应。

单组分解析诊断(component-resolved diagnostic,CRD)是检测过敏食物中单一蛋白质分子的特异性IgE抗体(specific IgE,sIgE),也可理解为过敏原sIgE抗体谱的检测。鸡蛋蛋清比蛋黄含有更多的致敏蛋白,包括20多种不同的蛋白质和糖蛋白,其中卵类黏蛋白(ovomucoid,OVM,Gal d1,约占11%)、卵白蛋白(ovalbumin,OVA,Gal d2,约占45%)、卵转铁蛋白(ovotransferrin,OVT,Gal d3,约占12%)和溶菌酶(lysozyme,Lsy,Gal d4,约占3%)4种蛋白质已被确定为主要过敏原[2]。不同组分蛋白质具有不同的特性,如Gal d1由于其热稳定性和蛋白酶的存在,使其与熟鸡蛋过敏以及由此引起的持续过敏现象相关;Gal d2与Gal d1相比,具有更强的热不稳定性,故其与未煮熟的鸡蛋过敏相关。因此,鸡蛋过敏的组分诊断从方法学上会更准确,从临床应用角度也更契合“精准诊断、精准治疗、精准预防”的宗旨[3]。本课题组在前期建立光激化学发光分析(light-initiated chemiluminescence assay,LiCA)蛋清组分检测方法的基础上[4],对鸡蛋过敏患者进行蛋清4种主要过敏原组分蛋白sIgE抗体谱检测,力求获得sIgE抗体谱的分布特征,以期明确鸡蛋组分诊断的临床应用价值。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1研究对象 收集2021年5月至2022年5月就诊于天津市儿童医院消化科的鸡蛋过敏患者血清样本197例。其中男性118例,女性79例,年龄0～16岁。纳入标准:(1)符合IgE介导的鸡蛋过敏临床诊断标准[5],即摄入鸡蛋或鸡蛋制品后数分钟至数小时内出现令人信服的过敏反应(定义为荨麻疹、呼吸困难、喘息、呕吐、腹泻甚至过敏性休克等症状),再次进食同种食物后,症状重复出现或鸡蛋皮肤点刺试验反应呈阳性,或两者兼有。考虑到存在发生严重过敏反应的潜在风险,未进行口服激发试验。(2)鸡蛋sIgE抗体阳性(≥0.35 kUA/L)。排除标准:(1)诊断为非IgE介导的鸡蛋过敏,主要表现为迟发的胃肠道症状。(2) 无完整病历资料。另收集同期就诊的阴性对照血清样本6例,均为无过敏症状的健康儿童[6],其中男性2例,女性4例,年龄2～12岁。本研究经天津市儿童医院伦理委员会批准(批准文号:TMUHMEC2017008),患儿家属知情同意。

1.1.2主要仪器和试剂 高通量LiCA检测仪(上海博阳生物科技有限公司),科瑞迪全自动酶免仪(HB-500E)购自嘉兴科瑞迪医疗器械有限公司,发光微球及链霉亲合素包被的感光微球(北京科美诊断技术有限公司)。蛋清单组分过敏原卵类黏蛋白、卵白蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶(美国Sigma-Aldrich公司),生物素化山羊抗人IgE抗体(美国Thermo Fisher Scientific公司),过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒(江苏浩欧博生物制药有限公司)。

1.1.3抗原包被发光微球 取适量的发光微球用超纯水洗涤数次,用0.05 mol/mL 碳酸氢盐缓冲液(CBS,pH 9.6)重悬后取适量发光微球,分别与Gal d1、Gal d2、Gal d3、Gal d4抗原以质量比为8∶1混合,37 ℃ 震荡过夜,经还原、封闭后,超纯水洗涤以去除游离的抗原,最后加入发光微球保存液100 μL[20 mmol/L 4-(2-羟乙基) -1-哌嗪乙磺酸盐缓冲液HEPES、2 g/L 牛血清白蛋白BSA、0.1% ProClin300],调节终浓度至10 mg/mL,置于4 ℃保存备用。

1.2方法

1.2.1蛋清sIgE抗体检测 蛋清sIgE抗体检测采用酶联免疫捕获法,按照符博克sIgE检测试剂及科瑞迪全自动酶免仪(HB-500E)说明书检测。结果判读与分级遵照国际标准[7]:0级,0～0.35 kUA/L;1级,0.35～0.70 kUA/L;2级,0.70～3.50 kUA/L;3级,3.50～17.50 kUA/L;4级,17.50～50.00 kUA/L;5级,50.00～100.00 kUA/L;6级,>100.00 kUA/L。以≥1级为阳性。

2 结果

2.1蛋清sIgE抗体检测结果 本研究采用商品化试剂对197例蛋清过敏患儿样本进行蛋清sIgE抗体检测,具体sIgE等级及样本例数见表1。

表1 血清样本分级表

2.2鸡蛋过敏组分sIgE抗体阳性比例 采用LiCA技术检测197例鸡蛋过敏患儿血清,蛋清4种组分sIgE抗体检测结果见图1。其中139例(70.56%)患儿血清中含有卵类黏蛋白sIgE抗体,152例(77.16%)患儿血清中含有卵白蛋白sIgE抗体,69例(35.02%)含有卵转铁蛋白sIgE抗体,36例(18.27%)患儿血清中含有溶菌酶sIgE抗体,另有45例蛋清过敏患儿未检测出4种组分sIgE抗体。其中,卵类黏蛋白和卵白蛋白为主要的过敏蛋白。

注:A,蛋清4种组分sIgE阳性比例;B,1～4种组分过敏阳性比例。图1 血清卵类黏蛋白、卵白蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶抗体检出比例

在197例患儿血清中,22例(11.17%)仅含1种组分的sIgE抗体,67例(34.01%)同时含有蛋清4种组分中2种组分的sIgE抗体,46例(23.35%)同时含有蛋清4种组分中3种组分的sIgE抗体,22例(11.17%)同时含有蛋清4种组分的sIgE抗体,其中同时含有蛋清4种组分中的2种组分抗体的患儿人数最多。

2.3蛋清4种组分sIgE抗体表达水平 采用LiCA技术检测197例鸡蛋过敏患儿血清,如图2所示,其中患儿血清中卵类黏蛋白的sIgE抗体S/N高值分布较多,最高可达87.83,即表达水平最高,而多数溶菌酶和卵转铁蛋白的sIgE抗体S/N较低,溶菌酶sIgE抗体S/N最高仅为44,患儿体内抗体量及表达水平均较低。

图2 LiCA法检测血清中蛋清4种组分sIgE抗体的表达水平

2.4蛋清4种组分sIgE抗体表达模式 蛋清组分sIgE抗体表达存在显著个体差异性。在197例过敏患儿检测中,对卵类黏蛋白和卵白蛋白这一组合过敏的患儿人数最多,占所有样本的30.46%(60例),并且阳性率最高的4种模式中对每种组合过敏的患儿血清中均含有卵类黏蛋白sIgE抗体和卵白蛋白sIgE抗体,其中血清中含有溶菌酶sIgE抗体的患儿均含有1种或2种其余蛋清组分的sIgE抗体,并未检出单独对溶菌酶此种组分过敏的患儿(表2),有22例(11.17%)同时含有蛋清4种组分sIgE抗体(表3)。

表2 蛋清过敏组分sIgE抗体表达模式

表3 阳性率最高的4种致敏模式

2.5蛋清4种组分sIgE抗体水平与血清鸡蛋sIgE抗体的关系 将每位患儿4种组分sIgE抗体S/N值累加,与临床检测所得的鸡蛋sIgE抗体浓度进行相关性分析,结果发现二者具有相关性,但r=0.266 8,P<0.05,相关程度较弱 (图3A)。此外,不同的患儿对4种组分的过敏强度具有明显的个体差异(图3B)。

注:A,蛋清4种组分sIgE与鸡蛋sIgE相关性分析;B,患者蛋清4种组分sIgE强度分布。图3 患儿血清中混合组分sIgE抗体和4种单一组分sIgE抗体总和的相关性分析

3 讨论

目前,临床对鸡蛋过敏患儿的诊断主要依靠血清过敏原特异性IgE抗体水平,但是由于蛋清中含有23种致敏性或非致敏性的蛋白质,故其采用的天然变应原粗提物由于纯度不够,杂质较多,有时会导致假阳性结果,除此之外,单组分解析诊断对鸡蛋过敏患儿进行精准诊断具有重要的意义。

LiCA方法已被证实在过敏原sIgE检测时,其分析性能满足临床要求[8],此方法是一种基于两种微球之间发生氧化还原反应的免疫学分析方法,其具有高敏感性、高通量、检测迅速等优点,并且已被用于多种物质的检测。基于此方法已经成功建立了鸡蛋、牛奶、艾蒿、屋尘螨和猫皮屑过敏原的检测体系[9-13],故而本研究基于LiCA法对蛋清过敏4种组分sIgE进行了检测。结果发现,Gal d1和Gal d2的阳性反应率分别为70.56%和77.16%,明显高于其他组分,与国内外报道结果一致[14-17];30.45%的患儿对Gal d1和Gal d2同时过敏[18],整体来看,Gal d1的阳性强度较高,但是对Gal d2过敏的患儿人数最多,此结果与多项研究结果相符合,即亚洲地区阳性率最高的组分是Gal d2[19]。然而,另一项研究显示,在欧洲Gal d1 sIgE≥3.7 kUA/L是诊断儿童鸡蛋过敏最佳的临界值,Gal d1 sIgE有助于区分临床反应性鸡蛋过敏患者和对加热鸡蛋耐受的患者,并且在不同年龄的人群之间没有明显的差异;而诊断患儿对生鸡蛋过敏最佳的临界值为Gal d2 sIgE≥2.01 kUA/L[20]。因此针对Gal d1阳性强度高于Gal d2的原因可能是对Gal d1过敏的患者较多,受试者的年龄范围不同,以及食入鸡蛋的时间不同和种族的差异等。本研究发现有22.3%的患儿未检测到蛋清4种组分sIgE抗体,同时患者蛋清4种组分sIgE的累积含量与鸡蛋粗提物的sIgE含量相关程度较弱,原因可能是鸡蛋含有较多的组分,而此次研究主要关注了蛋清4种组分,其中未涉及到的其他鸡蛋组分。有研究表明部分鸡蛋过敏患儿对蛋黄中的血清白蛋白(Gal d5)[21]和YGP42 (Gal d6)较敏感[22]。同时,商品化的试剂检测鸡蛋sIgE含量主要采用的是天然变应原粗提物,其纯度不够,杂质较多,有时也会导致部分假阳性的结果。

综上所述,本研究发现鸡蛋sIgE抗体和蛋清4种组分sIgE抗体之间相关性较弱,且每种成分的致敏性差异较大,原因可能是由于本研究所使用的是蛋清4种组分纯品抗原,其主要是基于单一组分sIgE抗体的检测,而临床上检测鸡蛋过敏的商品化试剂采用的是鸡蛋粗提取物,其中不同的组分之间可能存在相互干扰。此外,也有部分鸡蛋组分在本研究中未涉及到。但是,本研究显示鸡蛋过敏的部分患儿其蛋清各组分sIgE抗体水平具有明显的个体差异。因此,鸡蛋组分检测可对鸡蛋过敏患儿的诊断和预防起到一定的辅助作用。在临床诊断过程中,对于婴幼儿来说鸡蛋是一种不可或缺的营养物质,而目前避免鸡蛋过敏的主要方法就是回避鸡蛋的食用,这对于患儿及其家属而言均是较困难的。因此,通过过敏原单组分解析可明确诱发鸡蛋过敏的具体组分,既可以提高诊断的准确性,也可为更精确的脱敏和更个性化的饮食提供参考依据[23]。