血清细胞外囊泡hsa_circ_0005075在复发性流产中的表达及临床意义*

刘金,曹相婷,崔荣淑,徐小飞,董召刚(山东大学齐鲁医院 .妇产科生殖医学中心,.检验科,济南 250012)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)发生率为1%～5%[1],目前尚无有效的诊断标志物。因此,寻找灵敏度及特异性较高的标志物诊断RSA是临床亟待解决的难题。环状RNAs(circRNAs)是一类内源性共价闭合的单链RNA,通过miRNA海绵、调控基因表达等方式发挥作用。研究表明,circRNAs与多种妊娠相关疾病密切相关,其在发生RSA时呈异常表达,并通过ceRNA机制参与RSA的发生、发展[2]。circRNAs可富集于细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs),在胃癌、肺癌等多种疾病中呈异常表达,是潜在的诊断标志物。赵婷等[3]发现,循环circRNAs能够稳定存在于血液等体液中,具有组织/细胞特异性和广泛表达等特点,在发生肺癌时的表达水平显著变化,可作为诊断、疗效监测标志物及潜在的治疗靶点。hsa_circ_0005075是新近发现的circRNA分子,其在结直肠癌中呈高表达,并可以促进肿瘤增殖和侵袭[4]。但目前血清EVs hsa_circ_0005075在RSA中的表达及诊断价值国内尚未见报道。本研究旨在分析EVs hsa_circ_0005075在RSA患者血清中的表达水平,以期评价其在RSA中的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集2021年5月至2023年3月山东大学齐鲁医院妇产科就诊的14例女性RSA患者和14例正常妊娠者(对照组)为训练集,64例RSA患者和48例对照作为验证集。RSA组年龄22～37岁,中位年龄为30岁,其中流产次数3次及以上的年龄22～37岁,中位年龄为30岁,流产次数2次的年龄21～37岁,中位年龄为30岁;正常妊娠对照组年龄19～40岁,中位年龄为30岁。RSA的诊断依据《复发性流产诊治中国专家共识(2022)》[5]。纳入标准:(1)年龄>18岁;(2)夫妻染色体核型正常;(3)生殖系统发育正常;(4)至少连续2次早孕期自然流产;(5)2个月内未使用抗凝或者促纤溶药品、激素或者免疫抑制剂;(6)距上次流产3个月及以上,就诊时处于未孕状态;(7)临床资料完整。排除标准:(1)因其他原因主动流产者;(2)患有糖尿病、心血管疾病或免疫系统疾病等;(3)2个月内使用抗凝或者促纤溶药品、激素或者免疫抑制剂;(4)生殖器官畸形或感染;(5)临床资料不完整。对照组为经B超和HCG确诊处于妊娠早期者,均无自然流产史,无糖尿病、自身免疫病等全身性疾病。本研究经山东大学齐鲁医院医学伦理委员会批准[(科)伦审第2021048号],各研究对象及家属知情同意。

1.2标本采集 采集各研究对象空腹静脉血3 mL于含有分离胶/二氧化硅添加剂真空采血管中,3 000×g离心10 min,分离血清,用1.5 mL Ep管分装,置于-80 ℃保存备用。

1.3仪器及试剂 QuantStudioTM5实时荧光定量 PCR仪(美国ABI公司),Cobas e601全自动电化学发光分析仪(德国罗氏诊断公司),Bio-FLASH全自动化学发光免疫分析仪(美国依诺瓦诊断公司),XW-80A涡旋震荡器(上海精科实业有限公司),Nanodrop One超微量紫外可见光分光光度计(美国Thermo Scientific公司)。甲状腺球蛋白抗体(antithyrocyte globulin,A-TG)、抗甲状腺过氧化物酶自身抗体(thyroid peroxidase antibody,A-TPO)检测试剂盒购自德国罗氏诊断公司,抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibody,ACA)、抗β2糖蛋白1抗体(anti-β2 glycoprotein 1 antibody,anti-β2GP1Ab)检测试剂盒购自美国依诺瓦诊断公司,exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit购自德国Qiagen公司,Hifair®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒、Hieff UNICON®Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

1.4血清A-TG、A-TPO、ACA、抗β2GP1抗体检测 RSA患者及正常妊娠血清A-TG、A-TPO浓度采用电化学发光法检测,ACA(IgA、IgG、IgM)、抗β2GP1抗体(IgA、IgG、IgM)浓度采用化学发光免疫分析法检测,操作严格按照仪器及试剂说明书进行。A-TPO参考区间为0～34 IU/mL,A-TG参考区间为0～115 IU/mL,ACA(IgA)参考区间为0～4.2 CU,ACA(IgG)参考区间为0～14.5 CU,ACA(IgM)参考区间为0～7 CU,抗β2GP1抗体(IgA)参考区间为0～4 CU,抗β2GP1抗体(IgG)参考区间为0～7.4 CU,抗β2GP1抗体(IgM)参考区间为0～3.6 CU。

1.5血清EVs hsa_circ_0005075检测

1.5.1RNA提取及逆转录反应 按照参考文献[6],利用exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit提取血清EVs中RNA,使用Nanodrop One超微量紫外可见光分光光度计测量每份样本的RNA浓度。取吸光度(A260 nm/A280 nm)值为1.8～2.0的样本用于后续试验,样本置于-80 ℃保存。按照Hifair®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA,样本置于-20 ℃保存。

1.5.2引物设计及实时荧光定量PCR hsa_circ_0005075引物采用cricPrimer1.2软件设计,来源于circbase数据库(ID为hsa_circ_0005075),引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。hsa_circ_0005075上游引物序列:5′-CCCCTGGACTCTCTCAAAATTC-3′,下游引物序列:5′-GTCTTGCCACTTGTGTTACCG-3′;退火温度60 ℃,产物大小为112 bp,18S引物来源于本课题组前期研究[7],上游引物序列:5′-AGGGACAAGTGGCGTTCAGC-3′,下游引物序列:5′-CGGACATCTAAGGGCATCAC-3′,退火温度60 ℃,产物大小为187 bp。PCR扩增使用Hieff UNICON®Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix进行。PCR反应体系为20 μL,包括10 μmol/L Hieff UNICON®Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,cDNA 2 μL,无菌超纯水补足体积。PCR循环参数:95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s,60 ℃退火/延伸30 s,40个循环。于60～95 ℃(0.15 ℃/s)用仪器自带软件采集荧光信号并进行分析,采用2-ΔΔCt法计算相对表达量,以18S为内参照。公式:ΔΔCt=[(实验组Ct目的基因-实验组Ct内参基因)-(对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)]。

2 结果

2.1血清EVs hsa_circ_0005075的表达水平 K-S检验结果显示,各组数据呈非正态分布(P<0.05)。Mann-WhitneyU检验结果显示,在训练集中,RSA组血清EVs hsa_circ_0005075的相对表达量为7.69(4.74,42.15),显著高于对照组的1.02(0.51,4.23),差异具有统计学意义(U=28,P<0.01)。而在验证集中,RSA组血清EVs hsa_circ_0005075的相对表达量为4.96(1.73,8.89),亦显著高于对照组的1.00(0.24,2.96),差异具有统计学意义(U=693,P<0.01)。此外,hsa_circ_0005075在流产3次及以上RSA患者中的相对表达量为7.50(1.32,17.69),虽然高于流产2次患者的4.76(1.74,8.23),但两组间差异无统计学意义(U=308,P>0.05)。

2.2血清 EVs hsa_circ_0005075在RSA患者不同临床病理参数中的表达 血清EVs hsa_circ_0005075的表达与RSA患者年龄、体重指数、月经周期、痛经等差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 血清EVs hsa_circ_0005075在RSA患者不同临床病理参数中的表达[M(P25,P75)]

2.3ROC曲线分析结果 以RSA为疾病组,正常妊娠者为对照组,血清EVs hsa_circ_0005075鉴别诊断RSA组和对照组的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.774(95%CI:0.686～0.848),当cut-off值为2.468时,其敏感性为70.3%,特异性为75.0%(图1)。

图1 血清EVs hsa_circ_0005075鉴别诊断RSA和正常妊娠的ROC曲线

2.4血清EVs hsa_circ_0005075与RSA患者A-TPO、A-TG、ACA、抗β2GP1抗体的相关性 Pearson相关性分析结果显示,血清EVs hsa_circ_0005075的表达水平与RSA患者A-TPO的表达水平相关(r=0.298,P<0.05),而与A-TG(r=0.042,P>0.05)、ACA[IgA(r=0.199,P>0.05)、IgG(r=-0.165,P>0.05)、IgM(r=-0.089,P>0.05)]、抗β2GP1抗体[IgA(r=0.188,P>0.05)、IgG(r=0.163,P>0.05)、IgM(r=0.017,P>0.05)]等的表达水平均无关。

3 讨论

Hsa_circ_0005075位于chromosome 1:2137735821415706,在结直肠癌和肝癌中表达上调[4,8],但其在RSA患者中的表达尚不清楚。本研究检测了RSA组和正常妊娠组中血清EVs hsa_circ_0005075的表达水平,发现血清EVs中hsa_circ_0005075在RSA组中的表达水平高于正常妊娠组,提示血清EVs hsa_circ_0005075是潜在的新型标志物,对鉴别诊断RSA和正常妊娠具有较好的临床应用价值。

早期文献报道[9],hsa_circ_0005075能够通过下调SIRT1的表达促进胶质瘤增殖和转移,发挥促癌作用。本研究结果显示,血清EVs hsa_circ_0005075与年龄、BMI指数、月经规律、痛经、流产次数等不相关,而这些因素与RSA的发病及进展息息相关。这提示hsa_circ_0005075可能与RSA患者的卵巢功能减退、胚胎着床稳定性下降、内膜容受性下降等无显著关联。分析原因可能是hsa_circ_0005075仅作为RSA的标志物,不参与疾病进展;或者该分子在不同的组织中发挥的作用不同;也可能是由于样本量较小,没有达到统计学意义。既往流产次数是RSA的独立危险因素,随着流产次数的增加,再次流产的发生风险将显著增加。本研究发现hsa_circ_0005075在流产3次及以上RSA患者中的表达水平高于流产2次的患者,但差异无统计学意义,分析原因可能是样本量不足所致,有待于扩大样本量进一步证实。

笔者通过绘制ROC曲线评估血清EVs hsa_circ_0005075鉴别诊断RSA患者和正常妊娠者的临床应用价值,发现其AUCROC为0.774,当cut-off值为2.468时,敏感性和特异性分别为70.3%和75.0%,这表明hsa_circ_0005075可能成为RSA筛查的预测因子,为RSA的诊断及治疗提供实验数据支持。

本研究发现血清EVs中hsa_circ_0005075的表达与A-TPO的浓度呈正相关,而甲状腺功能异常与RSA密切相关,影响胚胎着床发育,与文献报道一致[10]。本研究结果也显示血清EVs中hsa_circ_0005075的表达与血清ACA(IgA、IgG、IgM)和抗β2GP1(IgA、IgG、IgM)等RSA相关标志物均无关,推测原因可能与本研究纳入的患者例数较少,导致代表性不强有关。

由于RSA是妊娠常见的并发症,所以本研究没有选取其他妊娠相关疾病患者。同时,本研究主要是鉴别RSA患者和正常妊娠者,因此没有选取体检健康者作为对照组,后续会纳入体检健康者,评估hsa_circ_0005075在RSA诊断中的价值。另外,本研究纳入的样本例数仍偏少,且纳入的指标也未能涵盖RSA患者全部的检测指标,今后需进一步扩大样本量,增加指标的种类,并且联合多中心来探讨hsa_circ_000507的临床应用价值及其在RSA中的作用机制。