脆肉鲩器官组织胶原纤维染色观察

张玮岚，杜瑞雪，叶元土，肖旭全

（1.苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏 苏州 215123；2.江苏省水产动物与营养重点实验室，江苏 苏州 215123）

饲喂蚕豆（Vicia faba）可使草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肉质变爽脆、紧实、有型而不易煮烂的独特养殖方式备受推广及关注。这种养殖类型的草鱼外形与普通草鱼差异不显著，但肉质已发生显著变化，广东称之为“脆肉鲩”[1]。广东省中山市东升镇已成为全国脆肉鲩之乡。脆肉鲩独特的口味，营养价值高，深受大众青睐。相关研究主要集中在探讨脆肉鲩肌肉质构特性、肌肉营养成分、血液生化指标等，关于蚕豆如何引起草鱼肌肉脆化的机理也有报道和不同的探讨。有研究认为，肌肉的脆化和嫩度与肌肉结缔组织中胶原蛋白的含量有一定的相关性[2,3]；刘邦辉等[4]研究发现，脆化后的草鱼肌肉的胶原蛋白含量会有所增加；冷向军等[5]研究了蚕豆对草鱼生长和肉质的影响，表明胶原蛋白含量与肌肉耐折力存在相关性。

石蜡切片技术中常用的苏木精伊红（HE）染色难用不同颜色将胶原纤维和肌纤维区分开，但Masson 染色法可实现[6]。根据器官组织的渗透性不同，选择分子大小不同的阴离子染料染色。分子量小的阴离子染料易穿透红细胞等结构致密、渗透性低的组织；分子量大的阴离子染料只能进入胶原纤维等结构疏松、渗透性高的组织。最终把胶原纤维染成蓝色，把肌纤维染成红色。再结合Imaje J 图像处理软件分析Masson 染色图片，计算出胶原纤维容积分数（Collagen volume fraction,CVF），即在同一视野中，染成蓝色的胶原纤维面积与组织总面积的比值，了解胶原纤维在组织中的沉积情况[7]。投喂蚕豆是普通草鱼变化到脆肉鲩的主要条件，但蚕豆脆化的形成机理仍没有定论。脆肉鲩的器官组织、尤其是肌肉组织的结构发生了显著的变化。脆肉鲩肌肉组织中胶原纤维数量和分布及结缔组织结构的改变是否是“脆化”形成的主要原因？同时，肌细胞结构也会发生一定的变化，但是肌细胞类型是否发生改变呢？基于此，本试验通过Masson 染色方法，研究脆肉鲩器官组织中胶原纤维的数量和分布情况，以期为草鱼肌肉脆化是否是蚕豆诱导肌肉和其他器官组织中胶原纤维显著增加的分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用脆肉鲩体质量7.0 kg，普通草鱼体质量4.5 kg 取自广东省中山市东升镇。将活鱼解剖，取1.5 cm3的背肌（背鳍下部、侧线上部）及腹肌（背肌对应鱼体位置的腹部）肌肉样品，随后取心脏、肝胰脏、脾脏、前肠、中肠及后肠，用PBS 缓冲液冲洗，吸干表面后置于4%甲醛溶液中固定，用于切片；然后再取背肌测定质构特性。

1.2 方法

将染色后的切片置于（100×、400×）倍数的光学显微镜下观察并拍照。采用Imaje J 图像处理软件对各组织器官的胶原纤维进行定位，并随机对3 幅图像的胶原纤维面积进行测量，取3 幅图像均值计算出胶原纤维面积与视野总面积的比值，即为胶原纤维容积分数。

1.3 数据处理

试验结果用平均值±标准差（Mean±SD）表示，采用Microsoft Excel 2010 软件和SPSS 20.0 软件进行数据整理和独立T 检验分析。

2 结果与分析

2.1 普通草鱼和脆肉鲩背部肌肉组织显微结构观察和胶原纤维容积分数差异

普通草鱼和脆肉鲩肌肉经过Masson 染色后，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色；相同倍数下，背肌横切中可见肌纤维聚集成束，周围包裹大量疏松结缔组织，为不规则圆形（图1-A、1-B）。横切中可看出，胶原纤维主要在肌束膜中形成沉积。相比于普通草鱼，脆肉鲩的肌纤维排列杂乱，肌束较粗。在背肌纵切（图1-C、1-D）中，普通草鱼的肌纤维肌束间的间隙较大且宽，而脆肉鲩的肌纤维束排列更紧密。

图1 普通草鱼和脆肉鲩背肌的组织染色（100 ×）Fig.1 Tissue staining of the back muscle of grass carp and crisped grass carp (100 ×)

脆肉鲩背肌的胶原纤维染色比普通草鱼深、面积更大（图1）。脆肉鲩背肌横切面的胶原纤维容积分数是普通草鱼的1.27 倍，从纵切面测量则是普通草鱼的1.13 倍，脆肉鲩背肌的胶原纤维含量比普通草鱼高（表1）。

表1 普通草鱼和脆肉鲩背肌胶原纤维容积分数Tab.1 Volume fraction of collagen fiber in the back muscle of grass carp and crisped grass carp

2.2 普通草鱼和脆肉鲩腹部肌肉组织显微结构观察和胶原纤维容积分数差异

普通草鱼腹肌的横切面肌纤维直径更小，肌束分布松散，肌纤维间隙更大；从腹肌纵切面观察到，普通草鱼的肌束排列紧密且整齐，相比之下，脆肉鲩的肌束增粗，肌束间排列稀疏且不整齐（图2）。

图2 普通草鱼和脆肉鲩腹肌的组织染色（100 ×）Fig.2 Tissue staining of the abdominal muscle of grass carp and crisped grass carp (100 ×)

脆肉鲩腹肌的胶原纤维染色比普通草鱼深、面积更大。从表2 可知，脆肉鲩腹肌横切面的胶原纤维容积分数是普通草鱼的2.09 倍，从纵切面测量则是普通草鱼的1.11 倍，脆肉鲩腹肌的胶原纤维含量比普通草鱼丰富。

表2 普通草鱼和脆肉鲩腹肌胶原纤维容积分数Tab.2 Collagen fiber volume fraction of abdominal muscle of grass carp and crisped grass carp

2.3 普通草鱼和脆肉鲩肝胰脏、脾脏、心脏组织显微结构观察和胶原纤维容积分数差异

普通草鱼（图3-I）和脆肉鲩（图3-J）的肝细胞形态清晰，近似卵圆形，且细胞边界明显，细胞核单个、居中，呈圆形，肝细胞索不明显。相同倍数下，相比于普通草鱼，脆肉鲩的门管区动脉、静脉管壁间隙中有大量被染为蓝色的胶原纤维，窦周隙中散布胶原纤维，部分肝星状细胞中有胶原纤维。由表3可知，脆肉鲩肝胰脏的胶原纤维容积分数是普通草鱼的1.41 倍。脾脏实质由红髓和白髓构成，二者混合分布，分界不明显。白髓由较为密集的淋巴细胞及少量的吞噬细胞组成。普通草鱼脾脏组织切片中血窦较多，由大量血细胞聚集而成，形态不规则，且周围含Masson 染色染为蓝色的胶原纤维（图3-K）。在脆肉鲩脾脏组织切片中可见少量聚集成团的吞噬细胞被染为深蓝色，细胞质内有大量染为紫红色的颗粒。红髓区域由脾索和脾窦构成（图3-L）。脾索在切面上呈索条状，内含有大量被染成蓝色网状结构的胶原纤维，而脾窦位于脾索之间，脾窦窦腔中含有大量被染为红色的红细胞。

表3 普通草鱼和脆肉鲩胶原纤维容积分数Tab.3 Volume fraction of collagen fiber of grass carp and crisped grass carp

图3 普通草鱼和脆肉鲩肝胰脏、脾脏、心脏的组织染色（100 ×）Fig.3 Tissue staining of hepatopancreas,spleen and heart of grass carp and crisped grass carp（100 ×）

脆肉鲩脾脏的胶原纤维容积分数是普通草鱼的1.89 倍，远高于普通草鱼（表3）。心肌纤维呈螺旋状排列，可同时观察到心肌的横切和纵切面（图3）。从图3-M和图3-N 中均可看到各心肌纤维间由结缔组织相连，结缔组织内含有胶原纤维。脆肉鲩心脏的胶原纤维容积分数是普通草鱼的3.75 倍（表3），二者存在差异。

2.4 普通草鱼和脆肉鲩肠道组织显微结构观察和胶原纤维容积分数差异

由图4 可以清楚观察到普通草鱼和脆肉鲩肠道平滑肌的肌纤维和肌间结缔组织分布，前、中及后肠的平滑细胞间含有大量被染为蓝色的胶原纤维。相同比例视野内，普通草鱼前肠（图4-O）的平滑肌细胞与结缔组织染色分明，脆肉鲩前肠（图4-P）的平滑肌细胞间含有大量错综排列形成致密的束状结构的胶原纤维。普通草鱼中肠（图4-Q）平滑肌细胞间隙的胶原纤维分布为疏松的束状结构，排列不紧密，而脆肉鲩中肠（图4-R）的胶原纤维在平滑肌的内环行及外纵行间分布均匀。普通草鱼后肠（图4-S）的胶原纤维明显较少，平滑肌细胞间隙较大，外纵行间及内环行间仅较少胶原纤维，而脆肉鲩后肠（图4-T）的平滑肌细胞间胶原纤维分布分层，且胶原纤维的分布在外纵行间明显比内环行间多。

图4 普通草鱼和脆肉鲩前肠、中肠、后肠的组织染色（400 ×）Fig.4 Tissue staining of foregut,midgut and hindgut of common grass carp and crisped grass carp（400 ×）

脆肉鲩前、中和后肠的胶原纤维容积分数分别是普通草鱼的2.16 倍、1.68 倍和2.66 倍（表4）。脆肉鲩肠道的胶原纤维含量比普通草鱼丰富。

表4 普通草鱼和脆肉鲩肠道胶原纤维容积分数Tab.4 Volume fraction of intestinal collagen fiber of grass carp and crisped grass carp

与普通草鱼相比，脆肉鲩肠道组织中胶原纤维数量和分布密度非常明显，这是本研究的重要结果。这是否是草鱼摄食蚕豆之后，蚕豆成分在诱导胶原蛋白合成量增加、胶原纤维数量显著增加，并诱导疏松结缔组织显著增加首先从肠道组织开始？还是诱导肌肉组织变性主要位点就是在肠道组织？本文提供了很有意义的观察结果，但还需要系统试验深入研究。

2.5 普通草鱼和脆肉鲩肌肉的质构参数分析

由表5 可知，普通草鱼和脆肉鲩背肌的质构参数有所差异（P＜0.05）。脆肉鲩的硬度和咀嚼性分别比普通草鱼高24.63%和22.11%，差异显著（P＜0.05）。弹性变化不显著（P＞0.05）。

表5 普通草鱼和脆肉鲩肌肉的质构参数分析Tab.5 Analysis of muscle texture parameters of grass carp and crisped grass carp

3 讨论

3.1 脆肉鲩肌肉组织显微结构观察

Masson 染色切片对比和测量发现，脆肉鲩背肌、腹肌的胶原纤维含量比普通草鱼的胶原纤维含量要丰富；脆肉鲩背肌横切面的胶原纤维容积分数是普通草鱼的1.27 倍；纵切面是普通草鱼的1.13倍，脆肉鲩腹肌横切面的胶原纤维容积分数是普通草鱼的2.09 倍，纵切面是普通草鱼的1.11 倍，且胶原纤维大多存在于肌束膜的结缔组织间。脆肉鲩背肌的硬度和咀嚼性显著高于普通草鱼。林婉玲等[8]比较不同肌肉组织的质构特征时发现，脆肉鲩腹部肌肉脆度大于背部，提出引起脆肉鲩肉质清爽脆口的因素之一可能是肌束间隔膜组织增多，肌隔膜可能有胶原蛋白等结缔组织的成分。朱志伟等[9]也发现，脆肉鲩的肌肉胶原纤维含量极显著高于普通草鱼肌肉胶原纤维含量。陈度煌[10]在研究质构特性时发现，脆肉鲩肌肉硬度、咀嚼性和回复性比普通草鱼分布高15.4%、11.5%和9.76%。张曦等[11]研究发现，提升草鱼肌肉间胶原蛋白含量可以改善草鱼质构性能，增强草鱼肌肉品质。因此，肌肉中胶原纤维含量的增加可能是脆肉鲩肌肉脆化的因素之一。本试验结果显示，蚕豆诱导“脆肉鲩”的“肌肉脆性”形成，肌肉组织中胶原纤维数量显著增加，且分布状态发生显著变化；肌肉组织中疏松结缔组织增生；但肌细胞类型并未发生改变。这些结果对于探讨脆肉鲩肌肉脆化机制有重要意义，即饲喂的蚕豆组成物质中，含有诱导鱼体器官组织胶原蛋白质合成量和胶原纤维数量增加、疏松结缔组织增生的作用机制，可能是诱导肌肉“脆化”的重要作用机制。

3.2 脆肉鲩肠道组织显微结构观察

肠道是重要的消化吸收器官，机体的生长发育与肠道的组织形态密不可分。投饲蚕豆会抑制脆肉鲩前肠的蛋白酶活性[12]，降低脆肉鲩对饲料的消化利用率，增加了肠道的定向蠕动。鱼体肠道肌肉层与肠道节律性蠕动有关，肌层厚度增加有利于强化肠道消吸收功能[13]。而胶原纤维是支撑平滑肌结构的重要因素，与肌纤维间紧密连接，促进肠道平滑肌的收缩与蠕动。本试验结果显示，与普通草鱼肠道组织相比，脆肉鲩肠道疏松结缔组织显著改变，胶原纤维数量显著增加。肠道组织中，胶原纤维的显著增加是否是蚕豆成分（具体何种成分目前未知）诱导胶原蛋白合成、胶原纤维数量显著增加的首发位点？这个问题值得深入研究，这也是探讨蚕豆成分诱导“脆肉鲩”形成机制的重要内容之一。

3.3 结论

本文利用Masson 染色方法，观察了普通草鱼和脆肉鲩背部、腹部肌肉和心脏、肝胰脏、脾脏、前肠、中肠、后肠组织中胶原纤维数量和分布状态，显示出脆肉鲩的这些器官组织中胶原纤维数量较多、分布区域面积较大，组织中疏松结缔组织有增生的状态，尤其是肠道组织、血管壁周围的分布结果较为明显。本试验中，脆肉鲩背肌横切面、腹肌横切面的胶原纤维容积分数分别是普通草鱼的1.27 倍和2.09 倍，从脆肉鲩背肌纵切面、腹肌纵切面测量则是普通草鱼的1.13 倍和1.11 倍，脆肉鲩肝胰脏、脾脏、心脏、前肠、中肠及后肠的胶原纤维容积分数分别是普通草鱼的1.41 倍、1.89 倍、3.75 倍、2.16 倍、1.68 倍和2.66 倍。这些结果提示：草鱼肌肉脆化的机制可以更多地从肌肉、肠道等器官组织中胶原蛋白合成机制、胶原纤维数量变化等深入、系统的研究。