基于生物网络分析研究柑橘属果皮辅助预防2 型糖尿病作用

张 彦，闫 平, ，张 华，张 寒，郑梦迪，柴希艳

（1.西安医学院，陕西西安 710021；2.西安雨润百德健康管理有限公司，陕西西安 710065）

芸香科植物橘（Citrus reticulataBlanco）及其栽培变种的成熟果皮为陈皮[1]，最常见的变种为广陈皮即茶枝柑（Citrus reticulata'Chachi'）[2-3]。酸橙（Citrus reticulataBlanco）及其栽培变种的未成熟果实为枳壳[2-3]。以上品种与甜橙（Citrus sinensisOsbeck）的幼果为枳实[2-3]。近年来出现橘、橙、柑的园艺栽培变种及杂交种[2-3]，例如沃柑、砂糖橘等，其外果皮被广大消费者自行使用，用以理气健脾，燥湿化痰[1-3]，其活性成分中黄酮类、柠檬苦素类和挥发油类与代谢性疾病治疗密切相关[4-8]。有学者通过体内外实验证实橘皮有降糖的作用[9-10]。

糖尿病（diabetes mellitus，DM）为常见慢性病。我国是世界上糖尿病患病率上升最快的国家，约有1.1 亿患者[11]，其中2 型糖尿病（T2DM）占90%以上。目前治疗T2DM 除注射胰岛素外，可口服降糖药包括双胍类、α-糖苷酶抑制剂等[12]，而以上降糖药物存在不良反应，故寻找高效、低毒性的纯天然降糖活性物质来辅助降糖是重要的研究方向。抑制α-葡萄糖苷酶可影响人体对碳水化合物的消化吸收，从而抑制血糖升高[4]，故评价体外对α-葡萄糖苷酶抑制作用可快捷方便筛选降糖活性物质。

生物网络分析采用网络药理学，利用计算机技术和大数据从系统层次和生物网络的角度，对“成分-靶点-疾病”进行多层次交互，解析植物提取物中多成分之间的关联规律，阐释其药效物质基础及机制[13-14]。再用分子对接模拟成分和作用靶点间相互作用、结合模式和亲和力[15-16]。生物网络分析已广泛应用于活性成分发现与评价领域，但尚未见该方法对柑橘属植物果皮降糖作用的研究。

本研究先用体外α-葡萄糖苷酶抑制作用评价13 批柑橘属植物果皮的降糖效果，然后用生物网络分析中常用的网络药理学与分子对接技术预测其可能辅助预防T2DM 的成分与作用机制，以期阐明常见的芸香科柑橘属植物果皮可否作为保健品新资源应用于2 型糖尿病的预防中。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酵母源α-葡萄糖苷酶（26 U/mg）上海源叶生物科s技有限公司；PNPG（P-Nitrophenyl-d-D-glucopyranoside，4-硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷）上海麦克林科技有限公司；阿卡波糖（BR，纯度≥95%）都莱生物技术有限公司；无水乙醇（AR，纯度≥99.7%） 天津市欧博凯化工有限公司；Na2CO3分析纯，天津大茂化学试剂厂；纯净水 实验室自制；柑橘属植物果皮样品 自制，详见表1，晒干的样品均为室温16～22 ℃通风自然干燥。

表1 样品信息及来源Table 1 Sample information and source

Readman1900/1900plus 型光吸收型全波长酶标仪 上海闪谱生物科技有限公司；KQ5200E 型超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；N-1300D 型旋转蒸发仪、CCA-1112A 型冷却水循环装置、NVP-1000 型隔膜真空泵 东京理化器械株式会社；SQP 型电子分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 柑橘属植物果皮提取物浸膏的制备及体外α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 13 批柑橘属植物果皮50 ℃干燥60 min 后粉碎过24 目筛，精密称取样品5.0 g 置于250 mL 具塞锥形瓶中，加50 mL 无水乙醇200 Hz 超声提取30 min，过滤，提取2 次，合并滤液，减压浓缩，蒸干得样品提取物浸膏。

方法参考文献[17-18]。分别称取以上各样品60 mg 浸膏，于5 mL 容量瓶加PBS 溶解并定容，得12 mg/mL 的样品溶液，稀释得4、6、8、10、12 mg/mL的待测样品溶液。精密称取1.8 mg（26 U/mg）α-葡萄糖苷酶冻干粉于5 mL 容量瓶用PBS 溶解并定容，制得9.36 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液。称取PNPG 14.5 mg 于10 mL 容量瓶，用PBS 溶解并定容，制得4.8 mmol/L 的PNPG 溶液。称取5.2295 g Na2CO3，于50 mL 容量瓶溶解并定容即得1.0 mol/L Na2CO3溶液。称取60 mg 阿卡波糖，于5 mL 容量瓶溶解并定容，得12 mg/mL 的阿卡波糖溶液，稀释为4、6、8、10 mg/mL 阿卡波糖溶液。

在96 孔板中，各试剂加样体积见表2，依次加入PBS 缓冲液，α-葡萄糖苷酶溶液和样品溶液，37 ℃恒温孵育15 min，加入PNPG 溶液，37 ℃恒温30 min，加入Na2CO3溶液中止反应，在405 nm 波长下，用酶标仪测定不同浓度的样品在反应后吸光度。根据公式（1）计算样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率，其他按表2 加入，A5组为阳性对照，用样品溶液同浓度的阿卡波糖代替样品，平行操作三次。

表2 α-葡萄糖苷酶抑制实验加样表Table 2 Addition table for α-glucosidase inhibition test

式中：A1、A2、A3、A4分别为样品组、样品空白组、阴性对照组和空白组阳性的吸光度。

1.2.2 柑橘属植物果皮降糖活性成分的预测 从TCMSP 数据库和查阅中英文文献（截止2022 年4 月）获得柑橘属植物果皮的主成分，使用Chem-Draw 绘制2D 结构，将获取的成分名称导入Pubchem 网 站（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），将Pubchem 网站显示的2D 结构和绘制的2D 结构图进行比对，确认化合物，从Pubchem 下载其2D Save文件，导入到SwissADME 网站（http://www.swissadme.ch/），计算化合物的分子特性。根据胃肠道吸收和药物相似性规则的标准筛选标准来选择化合物，即GI=high 且drug-likeness 项下有大于等于两个yes[19-20]，将符合要求的活性成分编号列表。

生物活性化合物目标预测：将以上筛选的化合物导入Swiss TargetPredicition 网站（http://www.swisstargetpreduction.ch）预测药物作用靶点，下载靶点信息，以probability＞0 为标准，将化合物与靶点信息对应，整理靶点信息[21]。

靶点交叉获取共有靶点：MalaCards 数据库（https://www.malacards.org/）和GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）搜索“diabetes mellitus type 2”获得两个数据库中关于T2DM 的相关靶基因的信息。将柑橘属植物果皮活性成分作用靶点与Ⅱ型糖尿病靶点导入Venny2.1.0（https:bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）网站，得到活性成分与疾病的共同靶标。整理活性成分共同靶点，使用Cytoscape 3.9.0 软件（http://cytoscape.org/）绘制“橘皮活性成分-靶点-T2DM”网络图，使其可视化，并使用其内置的软件工具Network Analyzer 计算以及靶点的网络拓扑参数筛选出主要有效成分[22-23]。

1.2.3 柑橘属植物果皮可能降糖机制的预测 T2DM靶点的PPI 网络构建：将交集靶点上传到STRING网站（https://stringdb.org），限定物种为“Homo sapiens”，选择置信度（medium cofidence）＞0.4，隐藏网络中游离的靶点（hide disconnected nodes in the network），将结果以TSV 形式导出，并使用Cytoscape 3.9.0 软件将导入的TSV 文件转成可视化PPI 网络，并用小插件“CentiScape 2.2 Menu”，选中其中的度值（Degree），介度（Betweenness）和紧密度（Closeness）为指标，分析其结果得到陈皮干预T2DM 的核心靶点[19-20]。

GO 和KEGG 富集分析：将核心靶点导入Metascape（https://metascape.org/）网站进行GO 分析和KEGG 通路分析，以P＜0.05 条件进行筛选，将GO富集图和KEGG 富集图通过微生信（www.bioinformatics.com.cn）可视化[19-20]。

1.2.4 分子对接验证 将1.2.3 项下预测的关键靶点在PDB 数据库找到相应的蛋白，保存为PDB 格式。在PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）寻找Degree 值前四的活性成分即1.2.2 项下预测到的活性成分2D 结构，并以mol2 格式保存，用PyMOL 软件转化为PDB 格式。利用MOE 软件对蛋白进行去水、加氢、计算电荷、能量最小化等优化，后与活性小分子成分的PDB 格式进行对接，结合能＜-5.0 kJ/mol 结合力良好，数值越小结合能力越强[19-20]。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 柑橘属植物果皮体外α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

由表3 可知13 批柑橘属植物包括杂交种的果皮体外对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用。S1～S13 的半数抑制浓度IC50值分别为8.4、9.1、8.3、15.6、7.8、8.7、9.0、2.6、2.7、3.0、10.0、7.4、5.5 mg/mL，IC50值越小说明抑制活性越好，其中S8、S9、S10 即园艺栽培品种砂糖橘果皮各浓度抑制α-葡萄糖苷酶活性最好。故砂糖橘、沃柑、皇帝柑等常见的园艺栽培种、杂交种与该属药用品种陈皮、枳实、枳壳等同样有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，并呈浓度依赖关系，其中沙糖桔皮、沃柑等近年来涌现的园艺栽培品种果皮对酶抑制效果较好。

表3 不同浓度样品对α-葡萄糖苷酶抑制率（%）Table 3 Inhibition rate of α-glucosidase by samples with different concentrations (%)

2.2 柑橘属植物果皮降糖活性成分的预测

2.2.1 活性成分 从TCMSP 数据库和查阅文献共获得柑橘属植物果皮中黄酮类、萜类、柠檬苦素类、挥发油类和生物碱类等65 种主要化合物成分，经SwissADME 网站筛选出40 种生物活性化合物。均符合药物相似性和口服胃肠道吸收[21]，结果见表4。

表4 柑橘属植物果皮活性化合物信息Table 4 Information on active compounds of Citrus peel

2.2.2 柑橘属植物果皮干预T2DM 重要的目标化合物预测 从Swiss Target Prediction 网站中获得柑橘属植物果皮生物活性化合物的潜在目标。删除重复后确定了480 个橘皮活性成分靶点。从Mala-Cards 数据库和GeneCards 数据库通过搜索术语“diabetes mellitus type 2”共获得577 个关于T2DM的相关靶基因的信息。分别将收集的480 个活性成分靶点和收集的577 个T2DM 疾病靶点上传到Venny 2.1[19-22]，获取交集靶点共98 个见表5，可视化结果见图1。将活性成分与交集靶蛋白导入到Cytoscape 3.9.0 软件构建“柑橘属植物果皮成分-靶点-T2DM 网络图”，见图2。拓扑参数由高到低分别为α-松油醇、柚皮素、桔皮素、月桂酸，以上可能是橘皮辅助干预T2DM 重要的核心成分[19-22]。

图1 柑橘属植物果皮活性成分和T2DM 的共同靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of the common target of Citrus peel active components and T2DM

图2 柑橘属植物果皮活性成分-靶点-T2DM 网络图Fig.2 Network diagram Citrus peel active components-target-T2DM

表5 柑橘属植物果皮活性成分和T2DM 的共同靶点Table 5 Common targets of Citrus peel active components and T2DM

2.2.3 柑橘属植物果皮降糖作用靶点的预测 柑橘属植物果皮与T2DM 共有靶点的PPI 网络，见图3。将TSV 格式导出结果可视化，见图4。以度值（Degree unDir）介度（Betweenness unDir）和精密度（Closeness unDir）这三个标准[19-22]来筛选橘皮干预T2DM 的核心靶点，筛选出17 个核心靶点，见表6。其中AKT1、ALB、PPARG、VEGFA 靠前。

图3 柑橘属植物果皮治疗T2DM 共有靶点的PPI 网络Fig.3 PPI network of common targets of Citrus peel in the treatment of T2DM

图4 柑橘属植物果皮治疗T2DM 共有靶点的PPI 网络可视化Fig.4 PPI network visualization of common targets of Citrus peel in the treatment of T2DM

表6 T2DM 的PPI 网络核心靶点拓扑学分析结果Table 6 Topological analysis results of PPI network core targets of T2DM

GO 和KEGG 富集分析：将以上筛选出来的核心靶点导入metascape 网站进行GO 分析，包括三部分：生物过程（Biological process，BP）、细胞组分（Cellular components，CC）和分子功能（Molecular function，MF）[19-20]。以PValue Cutoff＜0.05 筛选[20-22]，共富集到284 个BP，6 个CC，38 个MF。根据P值筛选出来的前10 条BP、6 条CC 和前10 条MF，用微生信进行可视化处理，结果见图5。

图5 GO 功能富集分析组图Fig.5 Go functional enrichment analysis group diagram

由图5 可知，柑橘属植物果皮辅助参与预防T2DM 靶点的生物过程可能与氧化应激（response to decreased oxygen levels）、脂质代谢调控（positive regulation of lipid metabolic process）有关。可能与细胞膜（side of membrane）与内质网（endoplasmic reticulum lumen）功能有关。可能与脂质结合受体（lipid blinding）、转录因子（transcription factor blinding）、类固醇受体（nuclear steroid receptor activity）、RNA、DNA、结合转录辅酶（ligand-activated transcription factor activity）等分子功能有关[19-22]。

KEGG 通路富集分析经过P＜0.05 的筛选结果显示，柑橘属植物果皮辅助参与T2DM 过程共有51 条通路，P值筛选出靠前10 条通路，见图6。

图6 KEGG 通路富集分析Fig.6 KEGG path analysis

图6 可知，柑橘属植物果皮辅助参与预防T2DM 的通路分别为癌症中的通路（pathways in cancer）、HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathways）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcomaassociated herpesvirus infection）、癌症中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、PI3K-Akt 信号通路（PI3KAkt signaling pathways）、人乳头瘤病毒感染（human papillomavirus infection）、人巨细胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、VEGF 信号通路（VEGF signaling pathways）、肾细胞癌（renal cell carcinoma）、AGE-RAGE 信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）在糖尿病并发症中的作用[19-22]。

2.3 分子对接验证

将2.2.2 项下根据Degree 值分别筛选出来主要活性成分α-松油醇、柚皮素、桔皮素、月桂酸与2.2.3 项下得到的T2DM 相关核心靶蛋白AKT、VEGFA、PPARG 和ALB 做分子对接，打分结果见表7。结合能＜-5.0 kJ/mol 可认为结合能力良好，数值越小结合能力他越强。以此为筛选依据[19-22]，桔皮素与关键靶点生物亲和力最强，活性最好。桔皮素与关键蛋白对接2D 与3D 模型，见图7～图8。

图7 桔皮素与T2DM 分子对接2D 模型Fig.7 2D model of tangeretin-T2DM molecular docking

图8 桔皮素-T2DM 分子对接3D 模型Fig.8 3D model of tangeretin-T2DM molecular docking

表7 有效成分与T2DM 靶点对接打分Table 7 Docking score of active ingredient and T2DM target

3 讨论与结论

本研究发现芸香科柑橘属其果皮均可作为食品添加剂应用于糖尿病的辅助预防中，在保健领域有一定的研究价值，有较强的应用前景。如果将芸香科柑橘属植物及砂糖橘、沃柑等园艺栽培种和杂交种的果皮利用起来，可“变废为宝”，实现农副产品的综合利用与开发。通过生物网络分析，本研究初步揭示柚皮素、桔皮素、月桂酸可能为柑橘属植物果皮中辅助预防2 型糖尿病的活性成分。再结合分子对接初步揭示柑橘属植物果皮对2 型糖尿病辅助预防的可能作用靶点，有一定的创新性。

生物网络分析初步预测柑橘属植物果皮预防2 型糖尿病的机制可能通过氧化应激等途径，与炎症中的PI3K-Akt、Ras、HIF-1 信号通路及血管相关的VEGF 信号通路等有关[24]。具体作用如下：第一，调控PI3K-Akt 信号通路，与胰岛素调节有关[24-25]。胰岛素受体底物磷酸化，激活PI3K，刺激磷脂酰肌醇，再进一步激活调节葡萄糖转化和糖原合成的作用的AKT[24-25]。第二，调控RAS/MAPK 信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡、免疫应答，与炎症及血管新生的关系密切。第三，调控糖尿病视网膜病变相关的血管内皮生长因子VEGF 信号通路。桔皮素与以上通路中蛋白激酶B-1（AKT1）、白蛋白（ALB）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARG）、血管内皮生长因子A（VEGFA）结合作用良好，以上蛋白可能为柑橘属果皮降糖机制的主要作用靶点[26]。桔皮素可进入该活性蛋白中心，与蛋白受体形成氢键。分子对接可视化图可以看出其形成氢键的个数较多且作用力较强。但因时间有限以上猜想尚未通过体内及细胞水平的验证，后续将进一步完善。

综上所述，芸香科柑橘属植物果皮在预防2 型糖尿病方面有应用前景，可进一步深入研究。