基于HS-SPME-GC-MS 与电子鼻分析芹菜贮藏期间挥发性物质的变化

芦佳琪，吴玉珍，张 瑞，韩晶晶，熊爱生，郁志芳,

（1.南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095；2.南京农业大学园艺学院，江苏南京 210095）

芹菜（Apium graveolensL.）是伞形科重要蔬菜作物之一，近年来我国芹菜种植面积保持在1000 万亩以上，总产量大于2500 万吨[1]。研究表明，芹菜中膳食纤维可有效改善人们的肠胃功能，维生素C、维生素B2 的含量远高于大白菜等蔬菜[2]，其中的芹菜素、槲皮素和木犀草素等黄酮类物质具有抗炎、抗氧化和心血管保护功能[3]。

芹菜因其独特的风味而受到消费者的喜爱，但芹菜组织脆嫩、含水量高，采后易受机械伤害，失水萎蔫，随贮藏时间延长会发生腐败变质，产生异味，因此贮藏期间芹菜香气的变化是评价其品质的重要指标，确定贮藏期间芹菜特征香气成分，可为贮藏期间芹菜新鲜度的判断提供理论基础。迄今为止，关于芹菜籽、芹菜精油和加工后芹菜的挥发性物质研究较多，但对于新鲜芹菜叶片中的特征挥发性物质的组成及贮藏期间采后芹菜叶片挥发性物质的变化规律鲜有研究报道。鲍辰卿等[4]采用气相色谱-质谱/嗅闻联用仪分析4 种芹菜籽油树脂，鉴定出洋川芎内酯、β-瑟林烯等物质是芹菜籽油树脂中的关键香气成分。Sellami 等[5]采用顶空固相微萃取技术结合气相色谱-质谱联用分析提取的芹菜精油，鉴定出主要挥发性物质为Z-3-丁基苯酞（27.8%～38.4%）和3-丁基-4,5-二氢苯酞（34.2%～41.0%）。程碧君等[6]采用HSSPME-GC-MS 检测干燥后的芹菜叶粉，发现芹菜叶粉挥发性成分主要由柠檬烯（88.03%）和月桂烯（4.09%）组成。目前果蔬的香气成分分析技术主要有电子鼻和顶空固相微萃取技术结合气相色谱-质谱联用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）等[7-8]。电子鼻（E-nose）能快捷无损区分样品[9]，表征挥发性物质整体特征，但无法准确定性定量分析，而顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术可以进行挥发性物质定性定量检测[10]。HS-SPME-GC-MS 结合电子鼻可以更全面、准确地分析贮藏期间芹菜叶片中挥发性物质组成和含量变化。

本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术和电子鼻对新鲜和贮藏期间芹菜叶片香气进行分析，结合挥发性物质香气活性值（odour active values，OAV）筛选芹菜的特征挥发性物质，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析（cluster analysis，CA）探究贮藏期间芹菜叶片挥发性物质的变化规律，为进一步明确采后芹菜的香气特征提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芹菜 采于江苏宿迁生产基地，品种为‘瑞斯特’，采收时间2022 年11 月4 日；3-辛醇（98%）购于麦克林公司；正构烷烃（C7～C40标准品）购于安谱实验公司。

PEN3 型电子鼻 德国AIRSENSE 公司；Tri-Plus 300 型顶空自动进样器、TSQ 9000 三重四极杆GC-MS/MS 美国Thermo Scientific 公司；萃取头（60 μm DVB/CAR/PDMS）美国Supelco 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芹菜样品的处理 采收的芹菜以冷藏运输方式在4 h 内运送至实验室。挑选大小基本一致、无机械伤、无黄叶和病虫害的芹菜，置于常温（20.0±1.0 ℃）、相对湿度90%±5%条件下贮藏，于0、3、7、9 d 取样。每次实验样品3000 g。将采集的芹菜叶片，液氮冷冻后磨成粉末存放于-20 ℃冰箱；所有样品采集后，集中进行挥发性物质的测定。实验设三个生物学重复样品。

1.2.2 芹菜挥发性物质的萃取 HS-SPME 萃取芹菜中挥发性物质，参考田震等[11]方法并做了改动。通过HS-SPME 萃取芹菜叶片中的挥发性物质，将1 g 芹菜叶片粉末，20 μL 内标物3-辛醇（0.8 mg/mL）加到20 mL 顶空瓶中，于50 ℃孵化5 min。65 μm PDMS/DVB 固相微萃取头伸入顶空瓶40 mm，顶空萃取45 min，提取挥发性物质后，自动进样至气相色谱-质谱（GC-MS）系统，250 ℃解吸5 min。

1.2.3 GC-MS 条件 条件参考Wu 等[12]、Cai 等[13]方法并略做修改。GC 条件：采用HP-5 石英毛细柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为He，流速1 mL/min，不分流；升温程序：从初始温度40 ℃开始，以5 ℃/min 的加热速率升温至136 ℃，维持3 min，然后1 ℃/min 升温至140 ℃，维持6 min，最后10 ℃/min升高到240 ℃，维持1 min。

MS 条件：在电子电离（EI）条件下，质谱的离子源温度为300 ℃，电子能70 eV，扫描范围33～500 amu。

1.2.4 芹菜挥发性物质的定性定量分析 通过NIST 与Wiley 标准谱库对GC-MS 检测结果进行分析，选择匹配度大于80%的物质；将正构烷烃标准品按1.2.3 条件进样，得到正构烷烃的保留时间，对各化合物的保留指数（RI）进行计算，并结合数据库中化合物保留指数对比鉴定。

式中：tx表示待测物质的保留时间，min，tn表示待测物质流出前正构烷烃的保留时间，min，tn+1表示待测物质流出后正构烷烃的保留时间，min，且tn＜tx＜tn+1，n 表示碳原子数。

根据内标法（3-辛醇作为内标）对挥发性物质做定量分析，公式如下：

式中：Ci表示任一组分的含量，μg/kg，Cis表示3-辛醇的质量浓度，μg/kg；Ai表示任一组分的峰面积，Ais表示3-辛醇的峰面积。

1.2.5 芹菜香气活力值OAV 的计算 通过计算香气活力值评估挥发性物质的贡献，OAV 值≥1 的化合物通常被认为对香气特征有很大贡献。OAV 值计算公式如下：

式中：Ci表示任一组分的含量，μg/kg；Ti表示该物质在水中的阈值，μg/kg。

1.2.6 电子鼻测定 参考Wu 等[12]方法并进行修改。称1 g 芹菜叶片粉末于20 mL 顶空瓶中，用PTFE硅胶垫盖密封并室温（20.0±1.0 ℃）平衡30 min。样品采集时间：180 s；传感器清洗时间：60 s；进样流量：150 mL/min。设置5 个生物学重复。PEN3 E-nose各个传感器及对应的性能描述如表1 所示[14]。

表1 电子鼻传感器性能描述Table 1 Function description of E-nose sensors

1.3 数据处理

电子鼻数据为5 次生物学重复测定的平均值，GC-MS 数据为3 次生物学重复测定的平均值。利用Origin 2022b 绘制雷达图、主成分分析（PCA）和Pearson 相关性分析，使用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，以P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 贮藏期间芹菜叶片挥发性物质的HS-SPME-GCMS 分析

利用HS-SPME 与GC-MS 联用的方法，分析贮藏期间芹菜挥发性物质成分及含量。共鉴定出108种化合物（表2），新鲜和贮藏期间芹菜挥发性物质均稳定在105 种以上，远多于文献报道的74 种[15]；108 种物质中醇类21 种、倍半萜类21 种、酯类12 种、单萜类11 种、烯烃类7 种、苯酞类6 种、酮类6 种、酸类4 种、含氧萜类化合物4 种、醛类2 种和14 种其他类物质，其中醇类和倍半萜类物质种类数量远大于现有文献报道[15-16]。贮藏期间芹菜中新增的挥发性物质有α-愈创烯、3-(2,6,6-三甲基-1-环己烯基)-2-丙烯-1-醇和5,7-十二烷二炔-1,12-二醇，其中后两种物质为醇类。由图1 可知，新鲜芹菜总挥发性物质含量为165682.48 μg/kg，其中单萜类和苯酞类物质是主要的挥发性物质，占比分别为52.92%、19.93%，与Turner 等[17]、Xia 等[18]研究结果相似。贮藏9 d 期间总挥发性物质含量下降了40.92%，主要是单萜类物质和烯烃类物质含量减少，其中减少最多的单萜类物质下降了51.76%。

图1 不同贮藏时间芹菜叶片各类型挥发性物质占比（a）和含量（b）Fig.1 Percent (a) and content (b) of volatile compounds of celery leaves during storage

表2 不同贮藏时间芹菜叶片的挥发性物质组成和含量Table 2 Composition and content of volatile compounds in celery leaves during storage

单萜类物质是芹菜挥发性物质中含量最高的物质，贮藏期间含量和占比呈下降趋势，含量从87675.05 μg/kg 降低至42293.06 μg/kg，占比从52.92%下降至43.20%。其中具有清新的柑橘、薄荷气味的D-柠檬烯和提供青草香和橙花油香气的别罗勒烯是单萜类物质中占比较大的挥发性物质[19]。贮藏期间芹菜叶片中D-柠檬烯和别罗勒烯分别占挥发性物质总量的55.39%～21.24%、10.05%～11.32%，D-柠檬烯含量下降了81.5%，别罗勒烯第9 d 含量较第0 d 下降了33.41%。

倍半萜类物质在新鲜芹菜中含量为13139.78 μg/kg，贮藏期间占比从第0 d 的7.93%下降到第3 d的5.99%，第9 d 增大至8.75%。倍半萜类物质中丁香、松油香的β-瑟林烯和木香的石竹烯被认为是芹菜香气重要的贡献者[20]。贮藏期间β-瑟林烯和石竹烯含量在第3 d 分别下降了51.77%、26.6%，第7 d含量上升，分别是第3 d 的1.5 倍、1.6 倍。

苯酞类物质是芹菜中主要的挥发性物质，贮藏期间占比逐渐上升，从19.93%增加至28.97%，含量从33024.49 μg/kg 降低至28359.89 μg/kg。具有药草香和芹菜特殊气味的苯酞类物质洋川芎内酯A 和瑟丹酸内酯被文献报道为芹菜特征香气物质[21]。新鲜芹菜中洋川芎内酯A 和瑟丹酸内酯含量分别为14479.04、12379.44 μg/kg。贮藏期间洋川芎内酯A 呈下降趋势，下降了60.62%，瑟丹酸内酯含量上升了42.95%。

贮藏期间芹菜中的烯烃类物质种类较少，含量占比为7.56%～4.68%；醇类、酯类、醛类、酸类和酮类物质含量较少，共占比为3.60%～5.47%。

本研究还检测到目前少有报道的（R）-异香芹萜、α-芹子烯、α-律草烯、新植二烯和1-甲基萘等物质。（R）-异香芹萜具有类似柠檬的香气[22]，在新鲜芹菜中含量丰富，为11860.51 μg/kg。淡丁香气味的α-芹子烯和甜橙香气的α-律草烯[12]，贮藏期间含量分别下降了56.17%、11.79%。新植二烯具有清香气且刺激性较强[23]，新鲜芹菜中新植二烯含量为7689.84 μg/kg，贮藏期间含量降低了54.16%。1-甲基萘有类似萘的特殊气味[24]，贮藏期间含量下降了35.36%。

2.2 贮藏期间芹菜特征挥发性物质的OAV 分析

HS-SPME-GC-MS 分析获得的各物质含量并不能确定贮藏期间芹菜的关键和特征性挥发性物质，故而采用挥发性物质香气活性值（OAV）对贮藏期间芹菜关键挥发性物质进行筛选。当OAV 值≥1 时，该化合物对芹菜整体香气有一定影响，当OAV 值＞10 时认为该化合物对芹菜整体香气贡献极大。如表3 所示，贮藏期间芹菜共有31 种挥发性物质OAV 值大于1，主要是萜类和苯酞类物质，0～7 d 特征挥发性物质有31 种且组成相同，第9 d 特征挥发性物质减少了2 种，减少的是萜品油烯和对伞花烃。

表3 不同贮藏时间芹菜叶片OAV＞1 的特征挥发性物质Table 3 Characteristic volatile compounds with OAV higher than 1 in celery leaves during storage

新鲜（0 d）芹菜叶片中，D-柠檬烯、别罗勒烯、1-甲基萘和洋川芎内酯A 的OAV 值大于100，提示这些物质可能是新鲜芹菜的关键香气成分。贮藏期间，D-柠檬烯的OAV 值呈下降趋势，别罗勒烯OAV 值第0、3、7 d 基本不变，第9 d 开始下降，表明贮藏期间芹菜叶片中薄荷香强度逐渐降低，草香和橙花油香气减弱。新鲜芹菜中10-烃基香叶醇OAV 值＜1，贮藏9 d 后萜品油烯、对伞花烃的OAV 值＜1，表明具有玫瑰花香的10-烃基香叶醇是贮藏1～9 d 芹菜的特征挥发性物质，提供松木香的萜品油烯和提供柠檬香的对伞花烃是新鲜和贮藏1～7 d 的芹菜的特征挥发性物质。具有药草香和芹菜气味的苯酞类物质瑟丹酸内酯在第7 d 的OAV 值较大，表明第7 d 芹菜叶片中药草香和芹菜气味浓郁。此外，贮藏期间具有类似萘特殊气味的1-甲基萘OAV 值（356.63～551.72）较大。

根据31 种关键挥发性物质的OAV 值绘制热图，并通过层次聚类对其进行分析（图2），结果表明芹菜香气0 d 以桃金娘烯醇、（-）-乙酸香芹酯、α-蒎烯、D-柠檬烯、β-瑟林烯等为主要特征挥发性物质，具有薄荷香和青草香；（-）-异丁香烯是第3 d 的主要差异物质，提供了丁香香气；第7 d 主要以10-羟基香叶醇、β-蒎烯、对薄荷-1,3,8-三烯、石竹烯、瑟丹酸内酯为主要特征挥发性物质，具有甜香、木香和樟脑香；第9 d 以3-六氢-丁基苯酞、（E）-藁本内酯为关键香气物质，具有辛辣和药草气味。通过芹菜特征挥发性物质的变化判断芹菜的新鲜程度，为确定芹菜的最佳货架期提供了理论基础。

图2 不同贮藏时间芹菜叶片的特征挥发性物质聚类热图Fig.2 Cluster heat map of characteristic volatile compounds of celery leaves during storage

2.3 电子鼻分析贮藏期间芹菜叶片挥发性物质

对新鲜和贮藏不同时间后的芹菜叶粉进行电子鼻检测。贮藏期间，芹菜气味在10 个传感器上的响应值不同（图3）。新鲜（0 d）芹菜在各传感器上响应值最大，说明芹菜刚采收后气味更浓郁。不同贮藏时期芹菜气味的变化主要体现在W5S、W1S、W1W、W2S、W2W 传感器上，这些传感器对氮氧化物、萜烯类、醇类和部分芳香族化合物响应敏感，表明贮藏期间芹菜中氮氧化物、萜烯类、醇类和部分芳香族挥发性物质存在差异。

图3 不同贮藏时间芹菜叶片电子鼻的雷达图Fig.3 E-nose radar diagram of celery leaves during storage

采用主成分分析对电子鼻响应值数据进行分析，结果见图4。PC1 的贡献率为90.9%，PC2 贡献率为6.8%，总贡献率97.9%，说明PCA 可以很好地反映样本信息。第0、3、7、9 d 分布在不同象限，提示贮藏期间芹菜挥发性成分存在差异。第3、9 d 在PC2 轴位置接近，表明两者的主要挥发性物质相似；第3、7、9 d 在PC1 轴上与0 d 区分明显，故新鲜芹菜挥发性物质与第3、7、9 d 的芹菜存在显著差异。另外，W1S、W2S 对于第四象限贡献值较大，可以更好地识别第0 d 的样品。

图4 不同贮藏时间芹菜叶片电子鼻的PCA（a）、Loadings 分析图（b）Fig.4 E-nose PCA (a)，Loadings analysis chart (b) of celery leaves during storage

2.4 HS-SPME-GC-MS 与电子鼻相关性分析

以HS-SPME-GC-MS 鉴定含量较高的21 种化合物与10 个电子鼻感应器响应值进行Pearson 相关性分析，结果见图5。W1C、W3C、W5C 与乙酸芳樟酯、Z-亚丁基苯酞、3-六氢-丁基苯酞成正相关，表明W1C、W3C、W5C 传感器对芳香族化合物敏感；W1W、W6S 与D-柠檬烯、反式氧化柠檬烯、二氧化萜二烯成正相关，表明两个传感器对萜烯类化合物响应较大，W1S、W2S 感应器响应值与异香芹醇、γ-松油烯、5-戊基-1,3-环己二烯含量成正相关，但W1S、W2S 乙酸芳樟酯成负相关。W1C、W3C、W5C、W1W、W2S 传感器识别出的挥发性物质与其性能描述基本一致，表明引起电子鼻传感器响应值变化的物质主要是萜类、醇类、芳香型挥发性物质（r≥0.80，P＜0.05）。结合贮藏期间具有关联性物质的变化，电子鼻技术可应用于芹菜品质变化的快速判别。

图5 HS-SPME-GC-MS 与电子鼻相关性分析热图Fig.5 Heat map of correlation analysis between HS-SPME-GC-MS and E-nose

3 讨论与结论

Turner 等[15]比较了2018 年和2020 年收获芹菜的挥发性物质，分别鉴定出65 种、74 种化合物，其中单萜类物质占比最大，分别为55%、88%。Reale 等[16]测定四种不同芹菜的挥发性物质，检测到白芹、黑芹、野生型芹菜和普通芹菜挥发性物质分别有18、16、13、18 种，四种芹菜中柠檬烯含量最高，相对含量达到50%。本研究以冬季采收的芹菜叶片为材料，利用HS-SPME-GC-MS 鉴定出更多的挥发性物质数量，共检测出108 种化合物，鉴定出的挥发性物质种类远多于文献的报道，其中主要是单萜类和醇类物质数量多于现有报道[15-16]。此外，芹菜特征挥发性物质1-甲基萘是本研究检测到的特有物质，鲜有文献报道。造成这些差异的原因可能与芹菜基因型、收获季节、品种、取样部位、提取和分析方法的不同等有关。

贮藏期间，芹菜叶片中挥发性物质的含量总体呈逐渐下降趋势，且萜类物质占比逐渐减小，苯酞类和醇类物质占比逐渐增加。研究报道萜类物质在空气易被氧化生成含氧化物、萜烯醇类等，其中柠檬烯氧化后生成香芹醇，紫苏醇等氧化衍生物[28]。推测贮藏期间芹菜叶片中萜类物质占比减少，醇类物质占比增加，与柠檬烯等萜类物质被氧化为香芹醇和紫苏醇等醇类物质有关。另外，Song 等[29]研究结果表明萜类物质合成与萜类合酶有关，因此贮藏期间芹菜叶片中萜类物质含量减少可能与萜类合酶活性降低有关。目前关于植物中苯酞的生物合成的途径尚未明确，Yan 等[30]研究表明茉莉酸、脱落酸等植物激素在调节苯酞类物质的合成中起着重要作用，推测芹菜叶片中苯酞类物质含量的变化可能与植物激素调节有关。Wu 等[12]利用GC-MS 比较4 ℃和20 ℃贮藏条件下菊花脑挥发性物质差异，发现低温延缓了菊花脑挥发性物质的损失。李雪等[31]研究不同贮藏温度油麦菜采后香气成分变化，结果表明4 ℃贮藏可以减缓油麦菜香气成分的释放。基于以上研究，推测贮藏温度可能影响采后芹菜中的挥发性物质，在后续的研究中将探讨不同温度下贮藏对芹菜挥发性物质的影响。

GC-MS 与电子鼻结合已广泛应用于果蔬的香气成分鉴定，GC-MS 可以分析贮藏期间芹菜叶片中挥发性化合物的种类和含量变化，但无法分析样品香气成分整体特征变化[32]。而电子鼻可以识别样品整体香气轮廓，具有简便、无损、高效的特点[9]。电子鼻结合贮藏期间芹菜叶片特征挥发性物质的变化，可快速判别芹菜品质的变化。

本研究采用HS-SPME-GC-MS 和电子鼻技术分析20.0 ℃贮藏期间芹菜叶片挥发性物质的变化，共鉴定出108 种挥发性物质，单萜类和苯酞类物质为主要组分，新鲜芹菜总挥发性物质含量为165682.48 μg/kg，贮藏期间芹菜总挥发性物质含量逐渐降低，下降了40.92%，其中单萜类物质占比增大，苯酞类物质占比减小。结合OAV 值分析，得到D-柠檬烯和洋川芎内酯A 等31 种OAV＞1 的特征挥发性物质，芹菜香气0～3 d 主要以D-柠檬烯等萜类物质的新鲜青草香为主，3 d 至第7 d 以10-羟基香叶醇、瑟丹酸内酯等醇类和苯酞类物质的甜香和木香为主，第9 d 则以（E）-藁本内酯等苯酞类物质刺激性的辛辣风味为主。PCA 结果表明电子鼻可以区分不同贮藏时间芹菜叶片的香气，HS-SPME-GCMS 结合电子鼻技术可以更加全面、准确地分析贮藏期间芹菜叶片挥发性物质组成和含量及变化规律，本研究结果为明确芹菜的香气特征和判别采后芹菜品质提供了理论基础。