复配发酵剂对发酵香肠的品质及挥发性风味的影响

吴双慧，杨梓垚，牛 茵，何济坤，尹礼国，陈 娟,

（1.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾 644000；2.西南民族大学食品科学与技术学院，四川成都 610225）

发酵香肠是一种经过微生物发酵制成的具有特殊风味的发酵肉制品[1]，其品质与风味容易受到微生物影响。为了控制香肠的品质，在发酵过程中通常会加入微生物发酵剂，缩短香肠发酵的时间，保证香肠的感官品质和安全性[2]。乳酸菌和凝固酶阴性葡萄球菌是香肠中最常用的发酵剂[3]。在肉制品发酵过程中，乳酸菌可以发酵糖类产生乳酸，形成一些挥发性风味物质，改善肉制品的风味，同时可以降解肉中的蛋白质，提高肉制品的质地和口感，促进消化吸收[4-6]。葡萄球菌在发酵肉制品中的作用主要是产香、发色和保证安全性，是发酵肉中的功能性微生物[7]。Ge 等[8]发现从金华火腿中筛选的植物乳杆菌NJAU-01 可以明显改善香肠的颜色和质地。Wang等[9]通过接种植物乳杆菌MSZ2 和木糖葡萄球菌YCC3 于发酵香肠中，发现接种木糖葡萄球菌或植物乳杆菌可以抑制发酵香肠的有害细菌，增加其游离脂肪酸含量，从而改善发酵香肠的风味。Xiao等[10]将植物乳杆菌R2 和木糖葡萄球菌A2 接种在中国干发酵香肠中，发现植物乳杆菌和木糖葡萄球菌促进了香肠中的蛋白水解和脂肪分解，改善了香肠的风味。

在香肠发酵剂的研究中，植物乳杆菌和木糖葡萄球菌复配的研究主要集中在对香肠加工品质及安全性能的影响[11-12]，发酵香肠的最适发酵温度、菌种配比和接种量[13]，混菌发酵对香肠中脂肪酸氧化和组成[14]、理化和质构[15]的影响等方面。添加发酵剂通常能改善发酵香肠的风味特征，使发酵香肠的整体香气更加丰富、浓郁。然而，目前关于以挥发性风味物质含量和香型为依据评价发酵剂性能的研究鲜见报道。

根据实验室前期对大量发酵肉制品源葡萄球菌[16]和乳酸菌的分离和筛选结果，植物乳杆菌L77不仅生长速度快、产酸能力强、具有较好的生产适应性能（耐酸、耐盐、耐亚硝酸钠和耐低温），同时具有较好的产蛋白酶活性；木糖葡萄球菌S120 具有优良的过氧化氢酶、硝酸盐还原酶和脂肪酶活性。

本研究拟以植物乳杆菌L77 和木糖葡萄球菌S120 为试验对象，利用HS-SPME/GC-MS 技术等方法对单菌和混菌发酵香肠的常规理化和微生物、挥发性风味物质、感官品质等进行分析，并采用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）法确定关键和修饰性风味化合物，按照发酵肉制品典型风味特征油脂香、奶油香、花果香和其他香型对关键和修饰性风味化合物进行分类，以风味物质的数量、含量及香型为主要依据，评价发酵剂的性能，以期开发一种产香型发酵剂，并为发酵剂性能的客观评判提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料肉 购于四川省成都市武侯区洗面桥巷菜市场；试验菌株 植物乳杆菌L77 分离于家庭制作的香肠，木糖葡萄球菌S120 分离于成都市农贸市场购买的烟熏腊肠，保存于西南民族大学食品科学与技术学院；亚硝酸钠（食品级）购于四川金山制药有限公司；抗坏血酸（食品级）购于盛达食品添加剂有限公司；硝酸钠、葡萄糖、丙酮 分析纯，购于成都科隆化学品有限公司；食盐、白糖 购于超市；环己酮购于成都化夏化学试剂有限公司；PCA 培养基、MRS 肉汤/琼脂培养基、TSB 培养基、MSA 培养基、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）购于青岛海博生物科技有限公司。

MLS-3030CH 高温高压灭菌锅 日本三洋电器股份有限公司；ZWY-240 恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；Trace DSQ 型气相色谱-质谱（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）联用仪（配置Triplus 自动进样器）美国Thermo 公司；HR83 水分含量测定仪 METTLER-TOLEDO；UV1810S 紫外分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；CR-400 色差仪 柯尼卡美能达控股公司；XHF-D 高速分散器 宁波新芝生物有限公司；pH-4C+酸度计 成都世纪方舟科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株间的拮抗实验 挑取乳酸菌和葡萄球菌的单菌落，以十字交叉的形式划线于PCA 平板上，观察交叉处是否有菌落生长。

1.2.2 实验分组 本实验分为三组，分别是不接种任何菌株的空白对照组、只接种植物乳杆菌L77 的发酵香肠（乳酸菌单菌组）、同时接种植物乳杆菌L77-木糖葡萄球菌S120 的发酵香肠（复配组），乳酸菌和葡萄球菌的接种量均为107CFU/g。分别购买两批原料肉，进行两批次发酵试验，发酵至26 d 时，每批次各取样150 g，混合均匀，用于常规理化和微生物指标以及挥发性风味物质的测定。

1.2.3 发酵香肠的制作

1.2.3.1 发酵菌株的预处理 将-80 ℃保存的受试菌株以2%的接种量分别接种至MRS 肉汤和TSB培养基中活化，37 ℃，150 r/min 培养18 h，于4 ℃下，8000 r/min，离心5 min。弃去上清液，用生理盐水进行洗涤，将菌体悬浮，备用。

1.2.3.2 香肠加工配方与工艺 将购买的猪肉按照肥瘦4:1 的比例绞碎成肉馅，每1000 g 猪肉中加入食盐25 g，白砂糖10 g，硝酸钠和亚硝酸酸钠各70 mg，抗坏血酸500 mg，与相应发酵剂（接种量为107CFU/g）充分搅拌后在0～4 ℃条件下腌制24 h。将腌制后的猪肉灌入肠衣中，晾晒于室外，温度为10～20 ℃，平均相对湿度为65%，自然发酵26 d。

1.2.4 常规理化指标和微生物指标测定方法

1.2.4.1 微生物指标的测定 样品的处理与菌落总数、疑似乳酸菌和葡萄球菌的计数参考牛茵等[17]的方法。肠杆菌的计数参照《GB 4789.41-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验》[18]的检测方法。将第26 d 的样品梯度稀释后注入平板，然后倾倒VRBGA 培养基，混匀，于37 ℃培养48 h后取出计数，得到肠杆菌的数量。

1.2.4.2 pH 的测定 pH 的测定方法参照《GB 5009.237-2016 食品安全国家标准 食品pH 值的测定》[19]的测定方法。测定三次，结果取平均值。

1.2.4.3 水分含量的测定 每份样品取1 g 肉样于水分测定盘中，使用HR83 水分含量测定仪进行测定。测定三次，结果取平均值。

1.2.4.4 亚硝酸盐的测定 参照《GB 5009.33-2016食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[20]。测定三次，结果取平均值。

1.2.4.5 硫代巴比妥酸的测定 参照《GB/T 35252-2017 动植物油脂 2-硫代巴比妥酸值的测定 直接法》[21]。测定三次，结果取平均值。

1.2.4.6 色度值的测定 将样品均匀搅碎后，平铺于培养皿中，将样品表面按压平整，选取6 个不同部位，使用色差仪进行测定[17]。

1.2.5 发酵香肠挥发性风味物质的测定

1.2.5.1 样品的处理 取5 g 绞碎混匀的香肠肉样，装入20 mL 顶空瓶中，加入10 μL 内标环己酮，用压盖器密封，备用。

1.2.5.2 顶空固相微萃取/气相色谱-质谱分析方法（HS-SPME/GC-MS）HS-SPME 条件：首先将盛装有样品的顶空瓶于80 ℃恒温预孵化10 min，然后用50/30 μm DVB/CAR/PEMS 萃取针于80 ℃条件下萃取30 min，最后将萃取针在进样口230 ℃解析2 min。

GC 条件：使用TG-WAXMSB 极性色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），不分流模式，进样口温度230 ℃，升温程序：初始柱温40 ℃，维持3 min，再以5 ℃/min的升温速率升温至210 ℃，维持5 min，载气为氦气（纯度＞99.999%），流速1 mL/min。

MS 条件：接口温度210 ℃，传输线温度230 ℃，电压1.2 kV，全扫描模式，质量扫描范围40～500 m/z，扫描时间2 s，离子源温度250 ℃，EI 离子源，电子能量70 eV。

1.2.5.3 挥发性风味物质定性定量分析 定性分析：结果由计算机自动检索（NIST 08）进行定性分析，结合Xcalibur 软件系统进行手动对照检索，匹配度（SI）和反匹配度（RSI）要求均大于800，可能性大于80%。通过C7～C40的正构烷烃标准物，按照以下公式计算测定物质的保留指数（retention index，RI）。

式中：RI 为样品的保留指数；Tx、Tn、Tn+1分别为样品、正构烷烃Cn、正构烷烃Cn+1的保留时间，min。

定量分析：依据化合物的峰面积比值与含量成正比的原理进行分析，计算公式如下：

式中：C 为测定物质的质量浓度，μg/kg；Ax为测定物质的峰面积，AU·min；C0为内标物（环己酮）浓度，µg/μL；V 为内标物进样体积，μL；A0为添加的内标物峰面积，AU·min；m 为测定样品质量，g。

关键风味化合物的评定：参照刘登勇等[22]的方法，利用相对气味活度值（relative odor activity value,ROAV）法确定发酵肉汤中的关键挥发性风味物质。公式如下：

式中：OAV 为气味活度值（odor activity value，OAV）；C 为所测定的挥发性化合物的质量浓度，μg/kg；T 为相同物质的感觉阈值，μg/kg；ROAVi为某组分的相对气味活度值；OAVi为某组分的气味活度值，OAVmax为对样品总体风味贡献最大的组分的气味活度值。ROAVi≥1 的组分为所分析样品的关键风味化合物，0.1≤ROAVi＜1 的组分对样品的总体风味具有重要的修饰作用。

1.2.6 感官评定 参照Chen 等[16]的方法，由9 名训练有素的研究生组成感官评价小组，以质地、颜色、风味和整体接受度作为评定指标，其中1 表示非常厌恶，5 表示既不喜欢也不厌恶，9 表示非常喜欢，将分数汇总后取平均值。

1.3 数据处理

数据结果以“平均值±标准误”表示，采用Excel 2019 对不同处理组香肠的风味物质进行数据处理，Origin 2018 作图；采用SPSS Statistics 22 进行数据分析，利用Duncan 多重比较进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗实验结果

植物乳杆菌L77 和木糖葡萄球菌S120 的拮抗作用如图1 所示。从图中可以看出菌株交叉的部位依旧有菌生长，受试的植物乳杆菌L77 和木糖葡萄球菌S120 之间不存在拮抗作用，可以复配用于香肠发酵。

图1 植物乳杆菌L77 和木糖葡萄球菌S120 间的拮抗作用Fig.1 Antagonism between Lactiplantibacillus plantarum L77 and Staphylococcus xylosus S120

2.2 不同处理组发酵香肠的常规理化性质和微生物分析

2.2.1 发酵香肠的微生物指标 对发酵26 d 的3 组香肠样品的疑似乳酸菌数量、疑似葡萄球菌数量、细菌总数、肠杆菌数量进行了测定，结果如表1 所示。

表1 不同发酵香肠的微生物测定结果Table 1 Microbiological results of different fermented sausages

从表1 可以看出，接种了发酵剂的L77 组和L77-S120 组的细菌总数分别为9.01 和9.20 lg CFU/g，显著高于空白组（P＜0.05），但两个接菌组之间的细菌总数没有显著性差异（P＞0.05）。空白组的乳酸菌数量（7.72 lg CFU/g）、葡萄球菌数量（7.81 lg CFU/g）和细菌总数（8.09 lg CFU/g）均显著低于接菌组（P＜0.05），但肠杆菌数量（3.66 lg CFU/g）却显著高于接菌组（P＜0.05），说明接菌发酵有利于抑制有害菌的生长，这与李珊珊[23]、杨贝等[24]、梁蕊芳等[25]的结果一致。其中，L77 组未接种葡萄球菌，但葡萄球菌数量却显著高于空白组（P＜0.05），可能是因为MSA 平板的选择性较差，测定结果包含葡萄球菌和其他细菌。乳酸菌单菌组（L77）的乳酸菌数量为9.06 lg CFU/g，显著高于其他两个组（P＜0.05），复配组（L77-S120）的乳酸菌数量为8.44 lg CFU/g，显著高于空白组（P＜0.05），说明在添加乳酸菌的发酵香肠中，乳酸菌很快成为优势菌株，复配组中葡萄球菌与乳酸菌的生长形成竞争，葡萄球菌可能对乳酸菌的生长有一定的抑制作用。

2.2.2 发酵香肠的常规理化指标 乳酸能降低香肠的酸度，不仅能产生一种独特的乳酸香气，还能使肉制品中的蛋白质发生变性，从而改善香肠的组织结构、品质和口感。由表2 可知，两个接菌组的pH 分别为5.81 和5.82，均显著低于空白组（P＜0.05）。三个组之间的水分含量没有显著性差异（P＞0.05），可能是由于这几个组的香肠均处于同温度同湿度的通风条件下晾晒，因此失水率并没有很大的差异。TBARS 值是评价发酵过程中脂质氧化程度是否合适的指标[26]，脂肪氧化会使过氧化合物增多，从而导致香肠的感官质量下降。由表2 可知，L77 组和L77-S120 组的TBARS 值为3.05 和2.51 mg/kg，显著低于空白对照组（P＜0.05）。可能是由于葡萄球菌和乳酸菌能产生过氧化氢酶，抑制脂肪的进一步氧化[27]。L77-S120 组的TBARS 值又显著低于乳酸菌单菌组（P＜0.05），说明乳酸菌和葡萄球菌能够共同促进香肠TBARS 值的降低[27]，由此可见，添加复合发酵剂可以有效抑制香肠的脂质氧化。我国对于发酵肉制品中亚硝酸盐的残留量有明确的规定，其中发酵肉制品中亚硝酸盐的添加量＜150 mg/kg，发酵肉制品中亚硝酸盐的最后残留量＜30 mg/kg[28]。由表2 可知，空白组的亚硝酸盐含量为3.92 mg/kg，显著高于两个接菌组，乳酸菌单菌组也显著高于复配组（P＜0.05），复配组的亚硝酸盐含量最低。这说明复合发酵可能比单菌发酵更有利于降低香肠中的亚硝酸盐含量。

表2 不同发酵香肠的常规理化性质测定结果Table 2 Regular physical and chemical properties of different fermented sausages

2.2.3 发酵香肠的色泽变化 香肠的色度由L*、a*、b*三个指标共同决定，L*值为亮度值，与香肠水分含量有关，a*值为红度值，能反映样品的偏红度，b*值为黄度值，脂肪氧化和蛋白质变性都会增大b*[29]。发酵26 d 的香肠样品中，三个组之间的色度差异如表3 所示。

表3 不同发酵香肠色度测定结果Table 3 Chromaticity determination results of different fermented sausages

由表3 可知，复配组的L*低于空白对照组和乳酸菌单菌组，说明添加复配发酵剂加快了发酵的进行，使水分流失加快，从而导致香肠亮度降低。复配组的a*显著高于空白组和乳酸菌单菌组（P＜0.05），说明添加葡萄球菌会产生硝酸盐还原酶会将硝酸盐还原成亚硝酸盐，在发酵成熟的过程中，亚硝酸盐能与肌红蛋白结合形成一氧化氮肌红蛋白，使肉色呈现鲜红色[30]，从而使发酵香肠的a*值增加。乳酸菌单菌组和复配组的b*显著低于空白组（P＜0.05），这可能是由于接菌发酵抑制了腐败菌的生长和脂肪氧化。

2.3 不同处理组发酵香肠的主体挥发性风味化合物分析

风味物质对发酵肉制品的风味贡献作用主要依赖于其浓度和阈值。只通过浓度去评价挥发性风味化合物对风味的贡献是不全面的。采用ROAV 法筛选出对总体风味起关键作用和修饰性作用的物质作为主体风味化合物（ROAV≥0.1），结果如表4 和图2所示。

表4 不同发酵香肠主体挥发性风味化合物的相对气味活度值Table 4 Relative odor activity values of main volatile flavor compounds of different fermented sausages

图2 不同发酵香肠的主体挥发性风味化合物（ROAV≥0.1）的含量Fig.2 Content of main volatile flavor compounds(ROAV≥0.1) of different fermented sausages

从表4 中可以看出，不同组之间主体风味化合物的种类存在差异，L77-S120 组的主体风味化合物的种类最多，其中醛类物质有10 种，醇类3 种，酯类2 种，酸类有1 种，其他类有4 种。L77 组数量次之，醛类物质有7 种，醇类2 种，酯类有1 种，其他类有5 种。空白组数量最少，醛类物质有5 种，醇类3 种，酯类有2 种，其他类有2 种。总体来说，添加发酵剂组的主体风味化合物种类多于空白组，这可能是由于微生物促进了蛋白质、脂肪和糖等成分分解，其中由脂肪分解成的游离脂肪酸和蛋白质分解成的游离氨基酸是重要的风味前体物质，能够促进风味物质的形成[31]。

图2 表示了三组发酵香肠产生的主体风味化合物（ROAV≥0.1）的含量。产生的风味化合物主要分为醛类、酸类、醇类、酯类和其他类。

从图2 中可以看出，在主体挥发性风味化合物的分类中，其他类物质含量最多，酸类仅在L77-S120 组中存在，L77-S120 组主体风味物质的含量最多。这些风味物质主要是由脂质氧化分解、蛋白质降解以及碳水化合物的分解产生[32]。醛类是脂肪降解的典型风味之一[33-34]，由于阈值较低，因此对整体风味的贡献更为突出，主要来源于油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸的氧化，是发酵香肠中最重要的风味化合物。醇类的阈值较醛类高，对香肠风味影响不大，但醇类是醛酮化合物的前体物质，对风味主要起加成修饰作用。酯类化合物阈值较低，通常具有芳香味，含有短链脂肪酸的酯类大多带有水果香气，含有长链脂肪酸的酯类大多呈现较淡的油脂味[35]。其他类主要包括烷烃、吡嗪类等杂环化合物，烷烃阈值较高，对风味没有太大的贡献，吡嗪是糖和游离氨基酸的美拉德反应的产物，具有明显的烤坚果香[36]。

将主体风味化合物按照油脂香、奶油香、花果香和其他香四种香型进行分类，结果如表5 所示。

表5 不同发酵香肠主体挥发性风味化合物香型及含量（μg/kg）Table 5 Flavor type and content of main volatile flavor compounds of different fermented sausages (μg/kg)

从表5 中可以看出，与不接菌空白组和乳酸菌单菌组（L77）相比，复配发酵组（L77-S120）的油脂香、奶油香和花果香物质的数量与含量均为最多，分别为8 种（1525.5 μg/kg）、2 种（514.09 μg/kg）、7 种（1219.43 μg/kg）。其中，己醛和壬醛显著低于空白组和L77 组（P＜0.05），庚醛、（E）-2-庚烯醛、蘑菇醇和2-戊基呋喃显著高于空白组和L77 组（P＜0.05），反-2-辛烯醛、反-2,4-癸二烯醛、反-2-十一烯醛、2-乙基丁酸、癸酸乙酯、戊醛和壬醇仅在复配发酵组检出。乳酸菌单菌组（L77）的油脂香物质含量最少，为1050.98 μg/kg，可能是由于油脂香主要来源于醛类物质，由脂质自氧化和葡萄球菌的氨基酸代谢产生[37]，例如油酸自氧化形成己醛、庚醛、壬醛和2-十一烯醛，亚油酸自氧化生成戊醛、己醛和2,4-癸二烯醛[38]，加入乳酸菌发酵会抑制脂质氧化，减少油脂香物质的数量和含量。乳酸菌单菌组（L77）不具有奶油香，复配发酵组的奶油香主要由2-乙基丁酸和δ十二内酯决定，这两种物质分别由氨基酸代谢和脂质代谢产生。乳酸菌单菌组（L77）和不接菌空白组产生花果香的物质种类和含量相近，远低于复配发酵组（L77-S120）。由此可见，以发酵香肠主体风味化合物的数量、含量及香型特征为指标，使用复配发酵剂（L77-S120）比单菌发酵（L77）和不接菌发酵的香肠在香气丰富度和香气类型上更优。

2.4 不同处理组发酵香肠的感官评定结果

表6 为不同处理组发酵香肠的感官评分结果，其中L77 组和L77-S120 组的质地得分为4.83 和4.53，显著（P＜0.05）高于空白组。L77-S120 组的色泽和风味得分显著（P＜0.05）高于空白组和L77 组，与挥发性风味化合物的检测结果一致。对于香肠的整体接受度评分，L77-S120 组得分最高，与另外两个组具有显著性差异（P＜0.05）。

表6 不同发酵香肠感官评定结果Table 6 Sensory assessments of different fermented sausages

综上所述，添加发酵剂对香肠的质地、色泽、风味和整体接受度具有一定的影响，其中发酵剂复配（L77-S120）组优于单菌发酵（L77）组和空白发酵组，感官评分结果显示，L77-S120 组具有较好的质地、色泽、风味和整体接受度，更适合作为发酵剂进行生产与推广。

3 结论

本研究以不接菌发酵作为空白对照，通过主体挥发性风味化合物的数量和含量及香型、微生物数量、TBARS 值、亚硝酸盐含量和感官评定等探究植物乳杆菌和木糖葡萄球菌L77-S120 复配组和L77单菌组对发酵香肠品质和挥发性风味的影响。L77-S120 组的TBARS 值、亚硝酸盐含量和肠杆菌数量均显著低于空白组和L77 组（P＜0.05），接种发酵剂会抑制肠杆菌等腐败菌的生长，L77-S120 组的主体挥发性风味物质含量和数量均高于空白组和L77组，差异风味化合物包括庚醛、（E）-2-庚烯醛、蘑菇醇、2-戊基呋喃、反-2-辛烯醛、反-2,4-癸二烯醛、反-2-十一烯醛、2-乙基丁酸、癸酸乙酯、戊醛和壬醇，复配组的主体风味物质产油脂香、奶油香和花果香的能力高于单菌组和空白组。复配组的感官评价结果也显示L77-S120 组发酵香肠的综合品质最好。所以，复配组更适合作为发酵香肠的产香型发酵剂。