姜黄素对黄曲霉菌的生长抑制

杨友洋, 张丹凤, 王永海, 马志桃, 叶应旺

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

黄曲霉菌(Aspergillusflavus)是一种土壤腐殖真菌,玉米、花生等谷类收获前后都会腐烂作物的种子[1]。黄曲霉最适生长温度范围为25～42 ℃,其中最适毒素产生温度为28 ℃[2]。这些真菌会导致食物变质,甚至还会产生有剧毒的毒素,其中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)因其对肝的毒性和极强的致癌性而备受关注。动物食用含有黄曲霉毒素的谷物,严重情况可导致死亡,人类长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致胃癌、肝癌、肠癌等疾病的主要原因[3]。黄曲霉毒素对人类和牲畜造成严重的健康问题,因此超过100多个国家在食品与饲料中严格限制毒素水平,其中用于人类和奶牛的玉米受到最严格限制,为20/1 000 000 000[4]。近年来,尽管引进了新的抗真菌药物和防腐剂,但是由于耐药性和环境污染逐渐增加,寻找安全可靠的抗真菌药物引起全世界研究者的兴趣。

姜黄素(C21H20O6)是从姜黄根茎中提取的小分子量疏水多酚类化合物,也是姜黄的主要成分,具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等广泛的药理活性[5-6]。姜黄素被世界卫生组织、联合国粮食及农业组织归列为食品添加剂[7],也是我国在《食品添加剂使用卫生标准》(GB 2760—1981)中最早颁布的,是在食品中被允许使用的9种天然色素之一[8]。姜黄素作为天然光敏剂,对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、拟茎点霉、灰霉等致病菌均有抑制效果[9]。由于姜黄素良好的抑菌效果,在食品安全领域得到人们的关注和重视。

1 实验材料和方法

1.1 材料和试剂

黄曲霉菌株(JXZS-117-1)由中国农业科学院油作物研究所惠赠;姜黄素(纯度≥98%)购自Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)。

1.2 实验方法

1.2.1 孢子萌发率和芽管长度

参考文献[10]的方法,在90 mm的培养皿中加入10 mL的PDA,取100 μL收集的孢子液并用玻璃涂布棒在平板表面涂抹均匀。放置在28 ℃的恒温培养箱中静置培养12 h。在光学显微镜下观察萌发情况。记录和计算平板上孢子的芽管长度和萌发率,萌发率计算公式如下:

其中:S1为总的孢子个数;S2为萌发的孢子个数。

1.2.2 抑菌剂对致病菌生长抑制效果

根据文献[11]的方法,将在马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基培养7 d正常生长的黄曲霉使用5 mm打孔器,取菌饼于含0.3 mmol/L的姜黄素PDA的培养皿正中央,在空白对照组中只加入PDA。将样品放入28 ℃的恒温培养箱中培养3 d。观察并测量黄曲霉菌落直径。每个处理重复3次,进行3次实验。

1.2.3 毒素检测

根据文献[12]的方法并稍作改动。在10 mL的试管中加入5 mL的马铃薯葡萄糖培养液(potato dextrose broth,PDB),添加姜黄素使最终浓度为0.3 mmol/L,加入100 μL已过滤的5×105个/mL的黄曲霉孢子液,然后放置在转速为180 r/min、温度为28 ℃的恒温摇床中。在摇床中培养7 d后收集菌丝和培养液。将收集的菌丝在50 ℃的烘箱中烘干水分并不时地记录菌丝质量,待质量不再变化记录最终菌丝干重。

将去除菌丝的培养液加入到50 mL的离心管中并加入1 g NaCl,用pH=7的磷酸缓冲液稀释至25 mL,将溶液震荡混匀并超声30 min,过滤备用。准确量取5 mL滤液加入到免疫亲和柱中,然后将免疫亲和柱接到5 mL的注射器下,调整注射器流速使溶液以2 mL/min的流速缓慢流过免疫亲和柱,再以2 mL/min的流速用0.1%吐温/PBS清洗,用10 mL的蒸馏水清洗2次。弃去全部流出的液体,并将3 mL的空气注入免疫亲和柱,再用2 mL的色谱级甲醇洗脱毒素,收集洗脱液。洗脱液用0.22 μm的有机相过滤器过滤收集。准确吸取300 μL的样品加入样品收集瓶中待测。液相条件为:流动相为甲醇和水(体积比为70∶30),流速1 mL/min,柱温40 ℃。荧光检测激发波长360 nm,发射波长440 nm。

计算单位质量菌丝产生的毒素,计算公式为:

其中:T为单位菌丝产生的毒素量;c为毒素的检测浓度;m为菌丝的干质量。

1.2.4 洋葱穿透实验

参照文献[13]的方法,准备一个新鲜、无损伤的洋葱,用刀片在内表皮上切出一个边长1 cm的正方形,用无菌的镊子剥去洋葱的表皮,将撕下的洋葱内表皮装入含有50 mL无菌水的培养瓶中。密封之后将培养瓶放置在68 ℃的水浴锅中加热1 h以杀死洋葱细胞。加热结束后使用无菌蒸馏水将内表皮清洗2遍,清除表皮上的多余组织。配制5×105个/mL的黄曲霉孢子液,并在孢子液中加入姜黄素使其浓度为0.3 mmol/L,设置不含有姜黄素的空白对照。然后用移液枪取100 μL的孢子液加入到洋葱表皮,将孢子液在表皮涂抹均匀。将处理后的洋葱表皮放置在培养皿中保湿、避光、室温下孵育12 h后,加入0.25%的台盼蓝染液染色4 min,然后用移液枪小心地除去染液,再吸取无菌蒸馏水吹洗掉剩余的染液。最后制片在普通光学显微镜下观察拍照。

1.2.5 侵染花生实验

参考文献[14]的方法,并且稍作改进。准备孢子悬浮液并用血球计数板计数,制成5×105个/mL的孢子液100 mL。将花生粒称重记录,用1%的次氯酸钠浸泡1 min,取出后用无菌水冲洗2次,放置在超净台吹干。将花生放入孢子液中浸泡30 s,取出后放置在含少量无菌水滤纸的培养皿中,将培养皿放置在28 ℃恒温培养箱中培养7 d。对照组是用未处理的黄曲霉孢子液浸泡,设置空白对照。每个处理重复3次,进行3次实验。

1.2.6 花生感官评价

为了评价姜黄素的加入对花生的感官是否会产生影响,参考文献[15]的方法,对加入姜黄素的花生进行感官评价。具体操作为:将花生加入到0.3 mmol/L的姜黄素中进行浸泡,使用清水浸泡的花生做空白对照,浸泡结束后将花生放置在通风处晾干,2 d后将部分姜黄素处理的花生进行清水清洗。实验邀请13位人员对花生进行感官评价,通过对样品仔细观察、嗅闻和品尝,对各项指标进行评分,具体评价标准见表1所列。

表1 花生感官评价标准

1.2.7 抑菌剂对病原菌形态学的影响

根据文献[16]的方法并稍作修改,从7 d正常生长的黄曲霉菌板中截取菌饼,加入到含无菌水的培养瓶中,振荡充分,用两层擦镜纸进行过滤,取10 μL菌液放置在血球计数板中进行计数,获得5×105个/mL的孢子液;然后在添加0.3 mmol/L姜黄素的PDA培养皿中,吸取100 μL的孢子液加到培养皿中,用玻璃涂布棒将孢子液涂抹均匀,放置在28 ℃的恒温培养箱中培养7 d;再将处理后的黄曲霉菌重新提取孢子,加入含姜黄素的平板中,进行连续3代的培养并观察菌落形态和色素产生情况。每个处理重复3次,进行3次实验。

1.2.8 黄曲霉菌对姜黄素的耐受性分析

为了探究黄曲霉菌对姜黄素的长期处理会不会产生耐受性,在含有0.3 mmol/L姜黄素的PDA 平板上培养黄曲霉菌,待产孢后观察菌落形态并收集孢子,用无菌水过滤黄曲霉孢子,制成5×105个/mL的黄曲霉孢子悬浮液;取100 μL孢子悬浮液加入到含姜黄素和不含姜黄素的PDA板中,然后用玻璃涂布棒涂抹均匀。将接种好的平板放置在28 ℃的培养箱中,培养7 d。第7天收集平板上的孢子过滤,得到第1代姜黄素处理的孢子液;继续将得到的孢子液在姜黄素处理的平板中连续培养3代,获得第3代姜黄素处理后的黄曲霉孢子。然后使用第3代孢子进行花生侵染实验。每个处理重复3次,进行3次实验。

1.3 数据分析

所得数据使用Excel 2013进行统计计算,并用SPSS 17.0进行方差分析(ANOVA),计算平均值之间是否存在显著性差异用Duncan多重检验法,P<0.05认为差异显著,不同字母表示不同处理之间具有显著性差异。文中柱状图使用Origin 8.0进行绘制。

2 结果与分析

2.1 孢子萌发率和芽管长度分析

真菌侵染花生、玉米等主要通过如下途经孢子附着在其表面、在适当的环境下萌发、菌丝不断扩张,从而导致食物污染。抑制孢子萌发率和芽管长度是抑制真菌污染的重要指标。

姜黄素连续处理对黄曲霉的孢子萌发率和芽管长度抑制情况如图1所示。

图1 姜黄素对黄曲霉孢子萌发率和芽管长度的抑制作用

由图1可知:与污染阳性对照组相比,姜黄素处理组的黄曲霉孢子萌发率和芽管长度降低;污染阳性对照组的黄曲霉孢子萌发率为92.7%,姜黄素处理组的黄曲霉孢子萌发率为81.3%,降低了11.4%;黄曲霉孢子芽管长度实验中污染阳性对照组长度为45.8 μm,姜黄素处理组为32.6 μm,芽管长度降低了28.8%。结果表明,姜黄素连续处理可以在一定程度上抑制黄曲霉孢子萌发率和芽管长度(P<0.05)。

2.2 抑菌剂对病原菌抑制效果

为了探究姜黄素对黄曲霉是否抑制,首先在体外实验中,通过平板实验,在培养基中加入姜黄素观察其对黄曲霉菌落的生长情况。

姜黄素对黄曲霉的抑制情况如图2所示。从图2可以看出:姜黄素处理后明显地抑制了黄曲霉菌落的生长;相对于污染阳性对照组,黄曲霉正常生长直径平均为14 cm,而姜黄素处理组的黄曲霉生长直径为11 cm,抑制生长率为21.4%。可以看出,加入姜黄素对黄曲霉的生长具有抑制作用(P<0.05)。

图2 姜黄素对黄曲霉生长抑制情况

2.3 姜黄素对AFB1产生量的抑制作用

农产品遭受黄曲霉的污染主要是由于其能够产生致命性黄曲霉毒素B1,通过检测黄曲霉毒素B1含量,能够进一步评估姜黄素对黄曲霉的抑制作用。样品经过滤处理后,通过免疫亲和柱的富集,再经过三氟乙酸进行柱前衍生,样品置于高效液相色谱(high performance liquid chromatogrphy,HPLC)荧光检测器检测。黄曲霉毒素B1产量如图3所示。

图3 姜黄素对AFB1产生量的抑制作用

由图3可知:姜黄素处理组的黄曲霉毒素B1的产生量为23.8 ng/g,污染阳性对照组的产生量为47.5 ng/g;相比之下,姜黄素处理组毒素降低了46.9%。分析结果可知,姜黄素能够显著降低黄曲霉毒素B1的产生(P<0.05)。因此,姜黄素作为天然的抑菌剂具有极大的开发潜力。

2.4 洋葱穿透实验结果

黄曲霉在发生侵染时,本文首先通过芽孢萌发产生菌丝,然后通过菌丝汲取生存所需要的养分。菌丝的活力强弱会影响黄曲霉侵染的严重程度。通过对菌丝做洋葱表皮穿透实验,测试菌丝活力。

台盼蓝染色后在显微镜下观察,孢子穿透洋葱表皮如图4所示。从图4可以看出,污染阳性对照组在萌发生长后,菌丝穿透洋葱表皮进入洋葱细胞内,这会导致在洋葱细胞外部的菌丝会被台盼蓝染成蓝色,而留在内部的菌丝未被染色。姜黄素处理组的黄曲霉菌丝大都被染上了蓝色,黄曲霉的菌丝活性降低,说明姜黄素降低了黄曲霉菌丝的穿透能力。

图4 姜黄素对黄曲霉菌丝穿透力的影响

2.5 侵染花生实验结果

因为花生易受黄曲霉的侵染,所以在之前平板抑制实验的基础上,进一步评估姜黄素对黄曲霉的防控效果。黄曲霉侵染花生情况如图5所示。

图5 姜黄素对花生黄曲霉病的抑制作用

从图5可以看出,培养7 d后,污染阳性对照组花生全部发病,而姜黄素处理组的花生仅是轻微感染,发病情况明显低于污染阳性对照组,因此姜黄素具有开发为新型抑菌剂控制食品和饲料原料中黄曲霉污染的前景。

2.6 花生感官评价结果

花生感官评价结果见表2所列。由表2可知,浓度为0.3 mmol/L姜黄素的加入并不会显著影响花生的口感和气味(P>0.05),但是对于花生的色泽产生了显著性的影响(P<0.05),使用清水清洗后会显著减少姜黄素对花生色泽的影响(P<0.05)。结果表明,姜黄素的加入并不会影响花生的气味和口感,对姜黄素应用具有重要的意义。

表2 花生感官评价结果

2.7 抑菌剂对病原菌形态学的影响

通过实验发现,姜黄素连续处理3代对黄曲霉形态的影响如图6所示。由图6可知,在添加抑菌剂的黄曲霉中,姜黄素处理组连续处理3代孢子的颜色呈现出乳白色,而污染阳性对照组培养连续3代仍然呈现黄绿色。结果表明,姜黄素会抑制黄曲霉孢子色素的合成。

图6 姜黄素连续处理3代对黄曲霉形态的影响

2.8 黄曲霉对姜黄素的耐受性

为了探究黄曲霉对姜黄素的耐受性,通过对黄曲霉3代的不断培养,第3代孢子感染花生情况如图7所示。

图7 姜黄素平板连续培养3代黄曲霉侵染花生发病情况

从图7可以看出,在污染阳性对照组中花生全部发病,而在姜黄素处理组中,花生仅部分感染。这说明经过姜黄素处理3代后的黄曲霉孢子侵染能力明显下降。结果表明,经过姜黄素处理后产生的黄曲霉孢子的活性同样受到一定的抑制作用,黄曲霉对姜黄素并没有产生耐受性,因此姜黄素具有作为一种长期抑菌剂的潜力。

3 结 论

本文主要研究了姜黄素对黄曲霉的抗真菌效果。通过姜黄素对黄曲霉抑制效果、形态学影响、菌丝的活力检验、毒素产量检测、侵染花生实验以及黄曲霉对姜黄素的耐受性实验,初步证明姜黄素对黄曲霉具有抑制作用。下一步实验将对相关抑制机理进行研究,以期对黄曲霉抑制提供新的思路。