10种中药水提物对黄曲霉菌体外生长特性的影响

隋 明，朱克永,张崇军,王静霞，唐贤华,周荣清

(1.四川工商职业技术学院，四川都江堰 611830；2.四川大学轻纺与食品学院，四川成都 610000)

黄曲霉毒素主要由曲霉属真菌中黄曲霉菌和寄生曲霉菌在生长过程中产生的一种次生代谢产物，主要包括黄曲霉毒素B1、B2、G1等10多种，其中以黄曲霉毒素B1毒性最强。黄曲霉菌广泛存在环境中的土壤、植物果实中，主要以发霉及污染的玉米和花生中黄曲霉毒素含量较高，对人和动物具有致畸、致癌、致突变作用[1-3]。当人摄入过量的黄曲霉毒素时,会引发人的急性中毒及致癌，当动物采食了含有黄曲霉毒素饲料，导致动物生长性能和生产性能下降，严重者出现死亡，食品和饲料中黄曲霉毒素给人和动物的健康造成严重的威胁[4-6]。因此，世界各国对食品和饲料中黄曲霉毒素的含量进行严格的控制。中草药种类繁多且富含多种活性成分物质，具有清热解毒、抑制细菌生长、清除内毒素、低残留、无毒副作用、使用安全、绿色无害等多种优点[7]。国内外关于清热解毒中药抑制黄曲霉菌生长特性研究较少，因此，本试验选用了10种清热解毒中药水提物对黄曲霉菌体外生长特性进行研究，测定其对黄曲霉菌菌落生长抑制率、黄曲霉菌孢子生长抑制率和黄曲霉菌产毒量，为进一步研发去除食品和饲料中黄曲霉菌复方中药制剂及应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 黄曲霉菌CGMCC3.4408标准菌株由四川工商职业技术学院食品系实验室保存。

1.1.2 试剂与仪器 黄连、连翘、穿心莲、金银花、大青叶、蒲公英、板蓝根、射干、紫花地丁、白头翁10种清热解毒类中药购于成都市同仁医药有限公司；PDA培养基、察氏培养基、产毒培养基，北京奥星生物技术公司产品；AFB1检测试剂盒，南京建成生物工程研究所产品。隔水式恒温培养箱由上海恒科学仪器有限公司生产；全波长酶标仪由德国Eppendourf公司生产；PBST、培养皿、EP管、移液枪、分析天平及分析纯等常规试剂及仪器由本实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 中药水提物的药液的制备 用水提法制备中草药药液，将中药在烘干箱烘干，称量50 g，加入5倍～10倍的蒸馏水浸泡1 h～1.5 h，煮开后用文火再煎煮30 min，用12层纱布过滤，再加入5倍蒸馏水煮沸，用文火再煎煮20 min过滤药液。将两次所煮药液合并浓缩为每毫升含原药为1 g。离心后并调整其pH为7.2～7.4，分装、121℃灭菌10 min,4℃保存备用。

1.2.2 黄曲霉菌活化培养 黄曲霉菌CGMCC 3.4408标准菌株取出，在生物安全实验室进行试验，将菌株室温解冻后，在无菌的条件下接种PDA培养基上，28℃培养4 d～8 d后，挑取单个菌落进行扩大培养。

1.2.3 黄曲霉菌孢子计数 生物安全实验室无菌的条件下，取扩大培养的黄曲霉菌培养基，加入一定量的无菌的PBST，将用黄曲霉菌洗脱后，收集到EP管中，用无菌的PBST 8 000 r/min 5 min洗涤3次后，再用无菌纱布过滤3次除去黄曲霉菌孢子的菌丝，进行计数。用无菌的PBST调整黄曲霉菌孢子浓度为1×107cfu/mL备用。

1.2.4 黄曲霉菌菌落生长抑制率测定 生物安全实验室无菌的条件下，取不同种类的中药水提物药液1 mL分别涂布PDA培养基上，待中药水提物药液液体完全被吸收后，在PDA培养基中心按照中药水提物药液与黄曲霉菌孢子悬液1∶50比例，接种20 μL黄曲霉菌孢子悬液(1×107cfu/mL)，对照组不添加任何药物接种等量的黄曲霉菌孢子悬液，28℃恒温箱进行培养，分别在黄曲霉菌培养后48、72、96 h测量菌落大小。每种中药水提物做3个重复并3次试验结果平均值进行统计与计算不同种类中药水提物对霉菌生长的抑制率。霉菌生长抑制率(%)=(空白对照组菌落直径-试验组菌落直径)/空白对照组菌落直径×100。

1.2.5 黄曲霉菌孢子生长抑制率测定 在生物安全实验室中，取2.5 mL的察氏培养基分别加入等量的不同种类的中药水提物药液，分别接种500 μL的黄曲霉胞子孢液(1×107cfu/mL)，每种中药水提物做3个重复，对照组不添加中药水提物，28℃振荡培养，分别在振荡培养后的6、18、24 h取每种药水提物药液试验组及对照组培养液0.1 mL均匀涂布PDA平板，28℃培养4 d～8 d后，对黄曲霉菌孢子进行计数，黄曲霉菌胞子孢生长抑制率计算公式为：抑制率(%)=(空白对照组孢子数-试验组孢子数)/空白对照组孢子数×100。

1.2.6 黄曲霉菌产毒量的测定 在无菌条件下，向产毒培养基中均匀涂布2 mL甘油水溶液，待液体完全被吸收，分别接种黄曲霉菌孢子。将不同种类的中药水提物培养液0.1 mL分别接种于产毒培养基，分别培养6、18、24 h，同时需做空白对照组。将无菌的生理盐水和黄曲霉孢子悬液(1×107cfu/mL)按照1∶1比例配合均匀后，取0.1 mL用同样方法接种于产毒培养基中，35℃恒温培养15 d～20 d。每种中药水提物及空白对照做3个重复并3次试验结果平均值进行统计与计算。提取黄曲霉毒素，并按照AFB1检测试剂盒测定其产毒量。霉菌产毒量抑制率(%)=(空白对照组产毒量-试验组产毒量)/空白对照组产毒量×100。

2 结果

2.1 黄曲霉菌菌落生长抑制率测定结果

由见表1可知，10种清热解毒的中药水提取对黄曲霉菌菌落生长有不同程度的抑制效果，培养48 h时，黄连、金银花、蒲公英、紫花地丁、白头翁5种药物水提物对黄曲霉菌菌落生长的抑制率在15.3%～16.9%；随着黄曲霉菌培养时间的延长，10种清热解毒的中药水提取对黄曲霉菌菌落生长抑制效果也有所增加，到培养96 h时，黄连、金银花、蒲公英、板蓝根、紫花地丁、白头翁6种药物对黄曲霉菌的抑制率在达到21.4%～22.5%，其他药物对黄曲霉菌的抑制率在11.4%～15.8%。

表1 10种清热解毒中药水提物对黄曲霉菌菌落生长抑制率测定结果

2.2 黄曲霉菌孢子生长抑制率测定结果

由见表2可知，10种清热解毒的中药水提物对黄曲霉菌菌孢子生长有不同程度的抑制效果，培养48 h时，黄连、金银花、大青叶、蒲公英、板蓝根、射干、白头翁7种药物水提物对黄曲霉菌孢子的抑制率在19.2%～21.1%；培养18 h时，黄曲霉菌孢子抑制效果有所增加；培养96 h时，10种清热解毒的中药水提取对黄曲霉菌孢子生长抑制率达到了最高，其中，黄连、金银花、大青叶、蒲公英、板蓝根、射干、白头翁7种药物水提物对黄曲霉菌孢子的抑制率在53.1%～75.8%；其他药物水提物对黄曲霉菌孢子的抑制率在22.5%～39.3%。

表2 10种清热解毒中药水提物对黄曲霉菌孢子生长抑制率测定结果

2.3 黄曲霉菌产毒量的测定结果

10种清热解毒的中药水提取物对黄曲霉菌产毒量有不同程度的抑制效果，随着培养时间增长，10种清热解毒的中药水提取物对黄曲霉菌产毒量的抑制率也在增长，培养24 h时，10种清热解毒的中药水提取物对黄曲霉菌产毒量的抑制率最高，其中，黄连、金银花、板蓝根、射干、白头翁5种药物水提物对黄曲霉菌产毒量抑制率较高，为73.3%～89.6%，其他中药水提物对黄曲霉菌产毒量抑制率为42.6%～50.2%(表3)。

表3 10种清热解毒中药水提物对黄曲霉菌产毒量的抑制率测定结果

3 讨论

黄曲霉菌素主要的靶器官是肝脏，当动物和人采食了被黄曲霉菌污染的饲料和食品后，黄曲霉菌素蓄积在动物和人的肝脏中，导致肝解毒功能下降，产生的毒素在血液中迅速繁殖，随着血液循环造成全身的中毒状态[3-6]。黄曲霉菌素不仅会导致动物生长性能和生产性能下降，严重死亡，还可以导致人严重中毒，甚至致癌变[8-9]。因此，有效控制黄曲霉菌生长和产毒量，才能减少食品和饲料的黄曲霉毒素污染。相关研究表明了乳酸菌等益生菌制剂或者植物提取物对黄曲霉菌落生长、黄曲霉菌孢子生长及产毒量等方面均有一定的抑制效果[10-11]。中草药具有清热解毒、清除内毒素、使用安全、低残留、无毒副作用等优点[12]。但是，国内外关于中药抑制黄曲霉菌生长特性研究没有报道，因此，本试验选用了10种清热解毒中药水提物对黄曲霉菌落生长抑制率、黄曲霉孢子生长抑制率和黄曲霉产毒量等研究。本试验结果显示，培养96 h时，黄连、金银花、蒲公英等6种药物水提物对黄曲霉菌菌落生长抑制率为21.4%～22.5%；黄连、金银花、大青叶等7种药物水提物对黄曲霉菌孢子的抑制率在53.1%～75.8%；黄连、金银花、板蓝根等5种药物水提物对黄曲霉菌产毒量抑制率在73.3%～89.6%，从而证实了清热解毒类中药对黄曲霉菌落生长、黄曲霉孢子生长、黄曲霉菌产毒量具有较高抑制作用。本研究结果高于姚婉等[10]报道的乳酸菌对黄曲霉菌落生长和黄曲霉孢子生长抑制率。可能由于黄连、金银花、板蓝根等清热解毒类的中药可以抑制黄曲霉菌代谢和细胞壁的合成，从而能抑制黄曲霉菌落及孢子的生长。当黄曲霉菌菌落及孢子生长受到抑制时，黄曲霉菌的产毒量也会受到抑制。清热解毒类中药对黄曲霉毒素菌作用机理复杂，有待进一步研究。本试验为进一步研发去除食品和饲料中黄曲霉菌复方中药制剂及应用提供了依据。