棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰生长性能、饲料利用和肠道组织结构的影响

■ 何 明 贠 彪 钱雪桥 解绶启

(1.广东海大集团股份有限公司畜牧水产研究中心，广东广州 511400；2.农业农村部微生态资源养殖利用重点实验室，广东广州 511400；3.中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室，湖北武汉 430072）

鱼粉具有蛋白质含量高、氨基酸平衡和适口性好等特点，是水产饲料中最优质的蛋白源[1]。近年来，随着水产养殖业快速发展，人们对水产品的需求量增加和全球捕捞业产量降低，这使得水产饲料对鱼粉的需求量迅速增加。由于鱼粉资源短缺和价格暴涨，寻求新型蛋白源替代鱼粉以降低饲粮成本成为当前研究的热点。目前，已有研究表明，豆粕[2]、玉米蛋白粉[3]、大豆浓缩蛋白[4]、发酵菜籽粕[5]等植物蛋白源均能全部或部分替代水产饲料中的鱼粉。然而，植物蛋白源因其适口性相对较差、氨基酸组成不平衡和抗营养因子较多等因素，限制了在水产饲料中的添加量[6]。棉籽粕是一种优质的高蛋白非粮植物蛋白源，经常被用于替代水产饲料中的鱼粉[7]。但其含有的棉酚是一种具有很强毒性的抗营养因子，抑制养殖动物的生长和健康[8]。棉籽蛋白是棉籽粕的水醇提取物，具有相对较低的可溶性碳水化合物和棉酚含量，是一种具有较大潜力的新型蛋白源[9]。近年来，已有研究报道，棉籽蛋白可以有效的替代大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）[10]、黑棘鲷（Acanthopagrus schlegelii）[11]、乌苏里拟鲿（Pseudobagrus ussuriensis）[12]、大口黑鲈（Micropterus salmoides）[13]、虹 鳟（Oncorhynchus mykiss）[14]、草 鱼（Ctenopharyngodon idella）[15]、鲤鱼（Cyprinus carpio）[16]等饲料中的鱼粉，并确定了棉籽蛋白替代鱼粉的最适量，众多研究表明棉籽蛋白在不影响鱼类生长的情况下可以替代200～500 g/kg鱼粉。

斑点叉尾鮰是我国重要的水产养殖品种之一，具有适应性强、食性广泛、抗病能力强、生长速度快、肉质鲜美等特点。随着近年来我国水产品深加工行业的兴起，斑点叉尾鮰的养殖规模迅速扩大，2021 年产量达到36.3 万吨[17]，配合饲料容量近70 万吨。目前，斑点叉尾鮰养殖成本中饲料成本占65%以上，降低其饲料成本对于斑点叉尾鮰持续健康养殖具有重要意义。鉴于目前未见棉籽蛋白替代鱼粉饲喂斑点叉尾鮰的研究报道，因此，试验以斑点叉尾鮰为研究对象，考察棉籽蛋白替代鱼粉对其生长性能、饲料利用和肠道组织结构的影响，为棉籽蛋白在斑点叉尾鮰饲料中的合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

设计了鱼粉含量为100 g/kg 的斑点叉尾鮰基础饲料配方，采用棉籽蛋白分别替代基础饲料中0、20%、40%、60%、80%和100%的鱼粉（D1、D2、D3、D4、D5 组和D6 组），然后平衡各组的赖氨酸和蛋氨酸水平，制成6组等氮饲料（见表1）。饲料中添加5 g/kg的三氧化二钇作为指示剂，用于消化率的测定。所有原料由珠海海龙生物科技有限公司提供，其中鱼粉粗蛋白含量为67.2%，粗脂肪含量为8.6%（干物质基础），棉籽蛋白粗蛋白含量为65.3%，粗脂肪含量为2.0%（干物质基础）。所有原料均经过超微粉碎机粉碎后过80 目筛网，按照试验配方称重后通过混合机将原料充分混匀，然后采用膨化机制成粒径3 mm 的膨化颗粒饲料，通过烘干箱干燥后，储存于4 ℃冰箱备用，各试验组饲料氨基酸组成见表2。

表1 试验饲料配方及营养水平（风干物质，%）

表2 试验饲料氨基酸组成（干物质，g/kg）

1.2 试验用鱼与饲养管理

养殖试验在广东海大集团海鸥岛试验基地进行。试验所用2 000尾斑点叉尾鮰购买自广州市当地养殖户，在大网箱（6 m×3 m×2 m）中用基础试验饲料暂养殖驯化3 周，以适应试验环境和试验饲料。正式养殖试验开始前，将试验鱼饥饿24 h，然后选择健康且规格接近的1 200尾斑点叉尾鮰[初重（171±1） g]进入浮式网箱（2 m×2 m×2 m），随机分到24 个网箱，每个网箱50 尾鱼，每组4 个重复。每日按照1.5%～2%的投喂率定量投喂两次（06：00 和17：00）并记录投喂量、死鱼数量和重量。养殖试验周期为67 d，期间水温为24～30 ℃，溶氧＞7 mg/L。

1.3 样品采集与计算

养殖试验结束后，对所有网箱的鱼进行24 h饥饿处理后计数并称量总重。随机选取3条鱼用丁香酚麻醉，测量体长、体重后解剖分离内脏团，测量内脏团、肝脏重量，并记录；取出3 条鱼的前肠，剔除肠道膜系和脂肪，用0.86%冷冻生理盐水冲洗内容物，存于波恩试液中固定用于肠道组织切片。再随机取5条鱼解剖并收集后肠末端3 cm膨大处的粪便用于消化率测定。

计算增重率、饲料系数、成活率、肝体指数、脏体指数和肥满度。

增重率（%）=100×[终末体重（g）-初始体重（g）]/初始体重（g）

饲料系数（FCR）=摄食量（g）/[终末体重（g）-初始体重（g）]

成活率（%）=100×终末尾数（尾）/初始尾数（尾）

肝体指数（%）=100×终末肝脏重（g）/终末体重（g）

脏体指数（%）=100×终末内脏重（g）/终末体重（g）

肥满度（g/cm3）=100×终末体重（g）/[终末体长（cm）]3

1.4 指标测定

1.4.1 肌肉和饲料的常规成分和氨基酸

肌肉与饲料组成成分分析参考AOAC[18]方法进行。其中，水分含量采用105 ℃恒重干燥法测定，粗蛋白含量采用凯氏定氮法（2300-Auto-analyzer，FOSS，Hillerød，Denmark）测定，粗脂肪含量采用索式抽提法（36680-analyzer，BUCHI，Flawil Switzerland）测定，粗灰分采用550 ℃马弗炉高温灼烧恒重法测定。氨基酸测定采用日立8900全自动氨基酸测定仪进行测定。

1.4.2 营养物质利用率

饲料和粪便中钇元素的含量采用等离子原子发射 光 谱 法（Vista MPX，Varian Alo Alto，California，American）进行测定。

干物质表观消化率(%)=100×(1-饲料钇含量/粪便钇含量)

蛋白质表观消化率(%)=100×[1-（饲料钇含量×粪便粗蛋白质含量)/（粪便钇含量×饲料蛋白质含量）]

脂肪表观消化率(%)=100×[1-（饲料钇含量×粪便粗脂肪含量)/（粪便钇含量×饲料脂肪含量）]

1.4.3 组织学分析

前肠经过脱水、透明、浸蜡和包埋，采用半自动切片机(LEICA RM2145)进行厚度为5～6 μm 的连续切片。选取完整的石蜡切片展片烘干后采用H.E.染色法进行染色，最后中性树胶封片。染色剂采用苏木精伊红（H.E.），操作步骤为二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水、苏木精染色和自来水冲洗，然后用0.5%的伊红染色，梯度乙醇脱水入二甲苯。利用显微镜对切片进行观察与拍照，并观察前肠组织学特征。

1.5 数据分析

数据用“平均值±标准差”表示，采用SPSS 17.0版统计软件中one-way ANOVA 进行方差分析，并进行Duncan’s法多重比较，显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰生长性能的影响

由表3 可知，与D1 组相比，D5 组和D6 组的末体重和增重率显著降低（P＜0.05），饲料系数显著增加（P＜0.05）。

表3 棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰生长性能的影响

2.2 棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰形体指标和肌肉营养组成的影响

由表4可知，D3组、D5组和D6组的肝体比显著低于D1 组（P＜0.05）。肥满度和脏体比各组间无显著差异（P＞0.05）。由表5 可知，棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰肌肉的水分、粗脂肪和粗灰分含量均无显著影响（P＞0.05），D6 组 粗 蛋 白 含 量 显 著 高 于D1 组（P＜0.05）。

表4 棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰形体指标的影响

表5 棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰肌肉常规成分的影响（%）

2.3 棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰饲料利用的影响

由表6 可知，当棉籽蛋白100%替代鱼粉时，饲料的干物质表观消化率和蛋白质表观消化率显著下降（P＜0.05）。各组之间的脂肪表观消化率无显著差异（P＞0.05）。

表6 棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰营养物质利用率的影响（%）

2.4 棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰肠道形态的影响

由图1 可知，棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰肠道绒毛结构和上皮细胞完整性没有明显的负面影响。由表7 可知，棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰肠道的绒毛高度和肌层厚度无显著差异（P＞0.05）。

图1 棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰肠道组织结构的影响（前肠40×）

表7 棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰肠道形态的影响（μm）

3 讨论

3.1 棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰生长性能和饲料利用率的影响

研究表明，在水生动物的饲料中添加适量的植物蛋白源，有利于节约动物蛋白源和促进动物的生长[19]，但植物蛋白源通常因其氨基酸不平衡、适口性差、消化率低和含抗营养因子等因素，过量使用则不利于养殖动物的生长[20-21]。棉籽蛋白是一种优质的新型非粮蛋白源，通过脱绒、去壳、溶剂萃取提油和脱酚后，棉籽蛋白去除了棉籽表面绒壳等纤维成分以及游离棉酚等有害物质，使得蛋白质含量和营养价值得到了进一步提升；其次，棉籽蛋白本身并没有异味，并不会对饲料的适口性产生负面影响[22]。在条纹锯鮨上的研究表明，在鱼粉含量为350～400 g/kg 的饲料中，脱粉棉籽蛋白可以替代80%以上的鱼粉而不会对生长性能产生负面影响[23-24]；在美国红鱼（Sciaenops ocellatus）饲料中，在补充蛋氨酸和赖氨酸的条件下棉籽蛋白最高可以替代50%的鱼粉而不会对鱼体的生长性能和体组成产生影响[25]；在珍珠龙胆石斑鱼（♀Epinephelus fuscoguttatus×♂Epinephelus lanceolatu）上的研究却表明，棉籽蛋白最高只能替代饲料中34%的鱼粉[26]。说明在不同的养殖品种饲料中，棉籽蛋白替代鱼粉的水平存在较大的差异。本研究发现，在平衡赖氨酸和蛋氨酸的添加下，棉籽蛋白可以替代斑点叉尾鮰饲料中60%的鱼粉，说明棉籽蛋白可作为斑点叉尾鮰饲料中有效替代鱼粉的优质蛋白源。本研究还发现，棉籽蛋白替代80%以上的鱼粉时，斑点叉尾鮰的生长性能显著下降，这表明即使在饲料中补充限制性氨基酸，仍无法消除高植物蛋白饲料导致的负面影响。饲料中营养物质的消化吸收率是影响养殖动物生长性能的关键，研究表明，肉食性鱼类对高植物蛋白饲料的消化率显著低于高动物蛋白饲料[27-29]。本研究还发现，棉籽蛋白全部替代鱼粉显著降低了饲料干物质表观消化率和蛋白质表观消化率，这是导致高植物蛋白组斑点叉尾鮰生长性能下降的主要原因之一。虽然棉籽蛋白中的棉酚被有效的去除，但高比例的棉籽蛋白会增加饲料中纤维素含量，斑点叉尾鮰作为杂食偏肉食性鱼类，对纤维素的利用程度偏低，高纤维素水平会降低饲料消化率从而阻碍斑点叉尾鮰的生长。另一方面，饲料中高比例棉籽蛋白替代鱼粉后引起的其他非限制性氨基酸以及牛磺酸、胆固醇等功能性营养物质的不足也是导致斑点叉尾鮰生长性能下降的原因之一。张静雅等[30]研究了在高比例棉籽蛋白替代鱼粉饲料中添加牛磺酸，发现可以显著提高条纹锯鮨对饲料的氮储积效率，提高生长性能，故后期如何补充关键性营养物质以进一步提升棉籽蛋白在斑点叉尾鮰饲料中替代鱼粉的比例，有待进一步深入研究。

3.2 棉籽蛋白替代鱼粉对斑点叉尾鮰肠道健康的影响

肠道作为动物消化道的重要组成部分之一，在营养物质的消化和吸收等方面起重要作用，其肠道的肠绒毛健康程度决定了养殖动物对食糜中营养物质的吸收效率。研究表明，肉食性鱼类对饲料中植物性蛋白源的耐受水平较低，高比例植物蛋白替代饲料中的动物蛋白会导致鱼类肠道组织结构受损[31-32]。棉籽蛋白虽然去除了绒壳和棉酚，但在饲料中过高比例的替代鱼粉仍会导致肠道组织结构损伤。Liu 等[33]在大口黑鲈上的研究表明，棉籽蛋白替代饲料中75%的鱼粉显著降低了肠道的绒毛高度和宽度。Chen 等[21]发现棉籽蛋白替代饲料中36%以上的鱼粉会显著降低珍珠龙胆石斑鱼肠道肠绒毛高度、宽度和肌层厚度；Yin 等[26]在杂交石斑鱼上也证实了类似的结论。本研究结果表明，在斑点叉尾鮰饲料中棉籽蛋白替代鱼粉不会对肠道的完整性、肠绒毛长度和肌层厚度产生显著性负面影响，这与之前在其他品种上的研究结果存在差异。生态学研究表明，在食物不足的自然水域环境中野生成年斑点叉尾鮰会摄食部分维管植物和藻类[34]，这也导致了斑点叉尾鮰本身对植物性原料的耐受度和适应性要强于其他纯肉食性鱼类。向建国等[35]认为斑点叉尾鮰为肉食性鱼类，其胃部肌肉结构发达，但在长期的人工驯食条件下，可以摄食较高比例的植物蛋白；其次，本试验所采用的斑点叉尾鮰从小投喂商品料，对饲料中的高植物蛋白具有了较强的适应性。以上可能是导致此试验结果的主要原因。

4 结论

在鱼粉含量为100 g/kg 的基础饲料中，棉籽蛋白替代60%的鱼粉不会影响斑点叉尾鮰的生长性能、饲料利用率、肌肉营养和肠道组织结构；当棉籽蛋白替代比例达80%时，在不同程度上降低了斑点叉尾鮰的生长性能和饲料利用率。