茶多酚、鱼骨粉复合制剂对福瑞鲤生长性能、消化及抗氧化能力的影响

■ 杨梓欣 邓泳妍 张文琦 孔 晴 邹记兴 吕利群 唐汇娟*

(1.华南农业大学海洋学院，广东广州 510640; 2.上海海洋大学国家水生动物病原库，上海 201306；3.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306)

以绿茶提取物的茶多酚以及鱼骨粉等配制而成的复合制剂（商品名“血停”）是国家大宗淡水鱼类产业技术体系渔药研发与临床项目支持研发的应用试验与示范产品，是针对我国草鱼出血病（GCHD）的三种基因型草鱼呼肠孤病毒（GCRV）研制而成的。该制剂以拌饲投喂的轻简化技术形式在全国不同草鱼主养区进行了临床应用和推广，防控效果显著。绿茶提取物茶多酚主要活性物质为表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和槲皮素（QE）等[1]。研究发现，儿茶素的活性成分具有抗氧化[2-3]、抗突变[4]、降低胆固醇[5]、抑制细菌和病毒复制增殖[6]等生理功能；槲皮素可以提高抗氧化能力[7]、抗炎[8]、抗菌[9]、抗病毒[10]能力以及可以提高机体免疫水平[11]，提高水生动物的存活率。鱼骨粉中富含硫酸软骨素（CS），能够提高机体抗炎、抗氧化能力[12-13]，能够调节免疫功能[14]，可以抑制病毒增殖[15]。茶多酚、鱼骨粉复合制剂已被证实可以用于防治其他水产动物疾病，其核心成分EGCG 对嗜水气单胞菌和鲤疱疹病毒Ⅱ型感染的细菌性败血症、疱疹病毒造血坏死病有一定的治疗效果[16]，也有研究发现EGCG 可以抑制对虾的弧菌与对虾白斑病毒（WSSV）病原复制增殖[6]。此复合制剂已被证实具有较好的治疗效果，但水产病害向来防重于治，因此在易发病季节，抗病制剂往往作为动保制剂添加在饲料中投喂。复合制剂的投喂对养殖水产品的生长、体成分、抗氧化性能以及消化器官的结构和功能是否存在负面的影响，目前尚无相关的研究对其安全性进行评价。

福瑞鲤2 号（Cyprinus carpioFFRC）是国审水产新品种（品种登记号：GS-01-003-2017），是以建鲤（C.carpio var.jian）、黄河鲤（C.carpio haematopterus）和黑龙江野鲤（C.carpio haematopteru）为原始亲本，以生长速度和成活率作为主要指标选育而成的品种[17-18]。因此，本研究以福瑞鲤为对象，研究茶多酚、鱼骨粉复合制剂的添加对福瑞鲤生长、体成分、抗氧化性能以及消化器官的结构和功能影响，并对其安全性进行评价，同时为其在水产品中的使用提供有益的参考，促进水产养殖业的可持续健康发展。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

试验使用的茶多酚、鱼骨粉复合制剂是由山东争跃药业生产，主要成分是绿茶提取物茶多酚和鱼骨粉，饲料原料由佛山市南海区杰大饲料有限公司提供，试验组饲料按0.8%投喂量添加使用复合制剂，拌饲时先用适量的热水调和，再使之与饲料充分拌匀后晾干，并当天使用。营养成分如表1所示。

表1 试验饲料基本营养成分（干物质基础，%）

1.2 养殖试验

养殖试验在华南农业大学室内循环水养殖系统进行，养殖系统鱼缸容量为150 L（L×W×H=0.6 m×0.5 m×0.5 m），开始养殖前3 d 前用高锰酸钾对养殖缸、过滤池、滤网、过滤石及渔网进行消毒，48 h 后清洗，然后放水曝气24 h。福瑞鲤鱼苗由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心董在杰教授团队提供。鱼苗运到后在循环水养殖系统暂养2 周以上，期间投喂基础饲料，驯化使其适应新养殖环境。暂养结束后，挑选规格相近、健康无病的福瑞鲤180 尾，随机分为两个组，每组设置3个平行，每个平行30尾鱼，初始鱼平均重为（1.92±0.01） g，各组初始鱼总重和均重经统计并无差异。待鱼适应环境后分别投喂对照组、试验组饲料，每天09：00和17：00定时进行定量投喂，日投喂量为鱼体重5%，养殖共持续9周。

1.3 样本采集

试验结束后，禁食24 h，以养殖缸为单位称量末总重，同时统计福瑞鲤末尾数。每缸随机取3 尾鱼，称重记录后用封口袋装好保存于-20 ℃冰箱，留样用于全鱼体成分的测定。另外随机取9 尾鱼样品，进行其他指标的测定和样品采集。

①用丁香酚进行麻醉处理，测量体长和体重；②随机取6尾鱼，用1 mL的注射器从尾静脉采血，将血样轻轻注入1.5 mL EP（eppendorf）管中，每管约注入0.5 mL血样，室温静置4～5 h 后，在4 ℃条件下，4 000 r/min离心10 min制备血清，同组血清混合后分装在1.5 mL EP管中，-80 ℃冰箱中保存待用；③采血后的鱼进行解剖，其中3尾鱼取其肝脏、肠道放入EP冻存管中，液氮速冻后转入-80 ℃冰箱中冷冻保存，用于生理指标测定；另外3尾鱼称量其内脏团重、肝脏重，用于计算鱼体的形体指标；④随机取3 尾鱼，采集肝脏3 份、中肠1 cm左右3份，4%多聚甲醛保存，用于制作组织切片。

1.4 指标测定

1.4.1 生长及形体指标

试验结束对福瑞鲤存活率（SR）、增重率（WGR）、特定生长率（SGR）、饵料系数（FC）、肥满度（CF）、脏体指数（VSI）、肝体指数（HSI）等指标进行测定，具体计算公式参考Liao等[19]的方法。

式中：N0和Nt——分别表示加州鲈的初始尾数和末尾数；

W0和Wt——分别表示初始鱼总重和终末鱼总重（g）；

Wd——死鱼总重（g）；

t——养殖天数（d）；

WS、LS、Wl、Vl——终末鱼的体重（g）、体长（cm）、肝重（g）、内脏重（g）。

1.4.2 体成分的测定

按照国家标准的分析方法，测定全鱼和背部肌肉的体成分。测定水分含量参照GB/T 10358—2008。粗灰分含量测定参照GB/T 6438—2007。粗蛋白含量测定参照GB/T 6432—2018。粗脂肪含量测定参照GB/T 6433—2006。

1.4.3 血清生化指标测定

将分离的血清送至武汉塞维尔生物有限公司，通过血清生化分析仪进行生化指标测定。主要指标包括谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆汁酸（TBA）、三酰甘油（TG）、胆固醇（CHO）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）。由同一操作员对所有血清参数进行测定以确保数据的准确性。

1.4.4 组织切片制作

将固定后的肝脏、肠道组织送至武汉塞维尔生物有限公司，通过固定、脱水、石蜡包埋、切片（5～10 μm）、去蜡及H.E.染色后制作成组织切片。

1.4.5 酶活性测定

使用南京建成生物工程研究所有限公司的检测试剂盒对肠道中脂肪酶（LPS）活性（A054-2-1）、淀粉酶（AMS）活性（C016-1-1），肝脏和血清中超氧化物歧化 酶（SOD）活 性（A001-3）、丙 二 醛（MDA）含 量（A003-1）、过氧化氢酶（CAT）活性（A007-1-1），样品的前期处理以及测定方法参照试剂盒说明书。

1.5 数据处理

用Excel 和SPSS 25 软件进行数据统计和独立样本t检验，试验数据均用“平均值±标准误”表示，P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 复合制剂对福瑞鲤生长性能、形体指标和体成分的影响

如表2、表3 所示，与对照组相比，试验组福瑞鲤的终末均重、肝体指数均有下降趋势，存活率有上升趋势，但各组福瑞鲤的生长性能、形体指标和体成分等各指标均无显著性差异（P＞0.05），说明饲料添加茶多酚、鱼骨粉复合制剂对福瑞鲤生长无负面影响。

表2 复合制剂对福瑞鲤生长性能、形体指标和体成分的影响

表3 复合制剂对福瑞鲤体成分的影响（干物质基础，%）

2.2 复合制剂对福瑞鲤血清生化指标的影响

由表4 所示，与对照组相比，各血清生化指标在两组之间的活性差异均不显著（P＞0.05）。

表4 复合制剂对福瑞鲤血清生化指标的影响

2.3 复合制剂对福瑞鲤血清、肝脏抗氧化能力的影响

由表5 所示，试验组福瑞鲤血清、肝脏中过氧化氢酶（CAT）活性显著高于对照组（P＜0.05），而超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量均与对照组无显著差异（P＞0.05），表明添加复合制剂可提高福瑞鲤鱼体的抗氧化能力。

表5 复合制剂对福瑞鲤血清、肝脏抗氧化能力的影响

2.4 复合制剂对福瑞鲤肠道消化酶活性的影响

如表6 所示，试验组福瑞鲤肠道的脂肪酶活性显著高于对照组（P＜0.05），而试验组福瑞鲤肠道的淀粉酶活性与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。

表6 复合制剂对福瑞鲤肠道消化酶活性的影响

2.5 复合制剂对福瑞鲤肠道、肝脏组织结构的影响

由图1 所示，试验组福瑞鲤的肠道肌层厚度、绒毛高度显著低于对照组（P＜0.05），绒毛宽度显著高于对照组（P＜0.05），而隐窝深度、绒毛数量及杯状细胞数没有显著差异（P＞0.05）。

图1 复合制剂对福瑞鲤肠道组织结构的影响

由图2 所示。两组福瑞鲤肝脏的肝细胞和肝细胞核直径、肝细胞和肝细胞核体积均没有显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 添加复合制剂对福瑞鲤生长性能和形体指标的影响

特定生长率是指生长率与生长天数的比值，是衡量生长状况的常用指标之一。饵料系数是指增加一单位重量所消耗饲料的重量。现有研究显示，相似的初始体重、养殖8 周的条件下，福瑞鲤的原始亲本建鲤的特定生长率范围在3.90%～4.18%，饵料系数范围在1.16～1.34[20]。比较锦鲤（Cyprinus carpio haematopterus）[21]的研究发现，本次试验的福瑞鲤具有特定生长率高，饵料系数低的特点，说明福瑞鲤生长良好。

复合制剂的主要活性成分是茶多酚中的EGCG、槲皮素和鱼骨粉中的硫酸软骨素。研究发现，饲料中槲皮素和硫酸软骨素能分别促进乌鳢（Channa argus）[22]以及斑节对虾（Penaeus monodon）[23]的生长，但另外一些研究表明，茶多酚的低剂量的添加对罗非鱼（Oreochromis niloticus）的生长没有影响，但随着剂量的增加，罗非鱼的增重率表现出降低的趋势[24]。徐奇友等[25]研究发现，添加不同水平的茶多酚对虹鳟（Oncorhynchus mykiss）增重率、特定生长率和饵料系数未产生显著的影响。Zhang 等[26]在斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）日粮中添加茶多酚后发现，当添加量提高到4%时，斑点叉尾鮰增重率低于对照组。Fu等[27]和Pan 等[28]分别对稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）和杂交石斑鱼（hybrid grouper）研究发现，槲皮素以及茶多酚能分别提高两种鱼的存活率。由此可见，槲皮素和硫酸软骨素可能促进养殖生物的生长，而茶多酚对养殖生物的生长则表现出剂量依赖性，在本研究中，在几种活性物质的综合作用下，0.8%复方制剂的添加，对福瑞鲤的生长、存活、饵料转化系数、形体指数以及体成分含量均没有产生显著的负面影响。

3.2 添加复合制剂对福瑞鲤血清、肝脏、肠道生化指标的影响

转氨酶在机体氨基酸代谢过程中十分重要，谷草转氨酶和谷丙转氨酶是判断肝脏是否受损的重要指标，可以反映鱼类肝脏氨基酸和蛋白质代谢的状态[29]。本次试验中，试验组福瑞鲤血清与对照组各种生化指标均无显著性差异，这表明添加复合制剂对鱼体的健康状况没有影响。

机体中的抗氧化酶系统是由SOD 和CAT 等组成的，是防止自由基损伤的第1 道防线，其活性变化可以准确地反映机体内的抗氧化状态[30]。而MDA 是脂质过氧化的最终产物，它不能去除体内所有自由基，能反映机体脂质氧化及组织氧化损伤的情况[31]。研究发现，在大菱鲆（Scophthalmus maximus）饲料中添加0.02%～0.05%茶多酚能够显著降低血清MDA含量，且SOD活性随茶多酚的添加水平升高呈先升高后降低趋势，在0.02%的添加水平时显著高于对照组[1]。陈路等[32]在斑点叉尾鮰饲料中添加不同品种的绿茶能够显著提高肝脏SOD 活性，但是只有1%添加量的低剂量组能够显著提高肝脏CAT 活性。在虹鳟的研究中发现，各试验组与对照组相比血浆SOD活性差异并不显著，血浆MDA含量随着茶多酚添加量的提高呈现下降趋势，而肝脏MDA 含量在添加量大于100 mg/kg 后均显著上升[25]。槲皮素（QE）可清除自由基和活性氧物质，增加肝脏抗氧化能力。饲料中添加QE可以显著提高鲤鱼[11]、乌鳢[22]血清SOD、CAT活性，杂交石斑鱼[33]肝脏中SOD、CAT活性也显著提高，鲤鱼血清MDA含量显著下降而杂交石斑鱼肝脏的MDA含量并无显著变化。本次试验中，试验组福瑞鲤的血清、肝脏的SOD活性、MDA含量与对照组比较均无显著差异，而血清、肝脏中的CAT活性均显著高于对照组，这表明饲料中添加复合制剂对提高福瑞鲤抗氧化能力有正向作用。

消化酶包括脂肪酶、淀粉酶等，其活性会对肠道的消化、吸收能力产生重要影响[34]。对鲤科鱼类而言，肠中段是酶解蛋白质和淀粉以及吸收氨基酸的主要区域，中肠比前肠更能吸收营养[35]。本次试验中，试验组福瑞鲤中肠的脂肪酶（LPS）的活性显著高于对照组，而相应的淀粉酶（AMS）与对照组不存在显著差异，这与Pan等[36]在茶多酚降低杂交石斑鱼高脂饮食的脂质代谢结果相符。AMS是嗜酸性酶，本次试验中两组福瑞鲤的AMS活性相比不存在显著差异，表明复合制剂的添加并未影响鱼体内的酸碱平衡。李金龙[37]在青鱼饲料中添加50 mg/kg茶多酚时，肠道脂肪酶活性显著增加，而添加量增加至500 mg/kg后，肠道蛋白酶和脂肪酶活性显著降低。有研究指出，茶多酚能够结合和沉淀蛋白质，具有使消化酶变性的潜在能力，当摄入过量时可能会作为抗营养因子，抑制消化酶活性[38]。但在本研究制剂添加量的情况下，能促进福瑞鲤肠道的消化功能。

3.3 添加复合制剂对福瑞鲤肠道、肝脏组织结构的影响

肠道是水产动物消化、吸收营养物质的主要场所，肠绒毛的长度以及疏密程度、肌层厚度等都与机体消化吸收能力的高低密切相关[35]。绒毛高度和宽度的增加通常被视为肠道营养物质吸收表面积的增加，肌层厚度的增加则可以促进肠道的消化和吸收能力，它们都是评价鱼类肠道健康情况的指标[29]。本研究结果发现，试验组福瑞鲤肠绒毛短小稀疏，肌层厚度显著低于对照组。这与Roberta 等[39]、Ma 等[40]在斑马鱼、草鱼的研究结果，茶多酚能修复肠道屏障损伤不一致。这可能与高剂量茶多酚的会成为抗营养因子有关[38]，也可能与槲皮素在无外源压力情况下对机体几乎没有保护能力，甚至会引起组织损伤的情况有关[33]。

肝脏是鱼类最大的腺体，参与体内糖类、蛋白质、脂质等营养物质代谢过程，还可影响鱼类运动、代谢、生长、繁殖活动[41]。在鱼类研究中发现，添加茶多酚可缓解高脂日粮对幼龄杂交石斑鱼肝脏产生的损伤，随着茶多酚水平增加，肝细胞轮廓逐渐恢复正常，空泡明显减少[28]。本试验结果显示，两组福瑞鲤的肝组织结构正常，肝细胞呈规律、正常且大小排列均匀，肝细胞与细胞核的直径、体积均无显著差异，表明饲料中添加复合制剂不会对福瑞鲤的肝组织产生损伤。

4 结论

综上所述，茶多酚、鱼骨粉配制而成复合制剂被证实对一些水产疾病具有较好的治疗效果，在0.8%的添加剂量的情况下，对福瑞鲤的生长性能、体成分不会产生负面影响，可提高福瑞鲤的消化、抗氧化能力，可以作为一种饲料添加剂增强水产动物的抗病力。但由于其对肠道的组织结构可能产生一些负面影响，因此，需要对其使用的周期开展进一步的研究，以充分发挥其优势，减少其负面影响。