原花青素对泥鳅生长、免疫功能及抗氧化能力的影响

■ 方琼亚 孔祎頔 李 民 李 科 刘晓蕊 刘海惠 王桂芹

（吉林农业大学动物科学技术学院，动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，现代农业技术教育部国际合作联合实验室，吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，吉林长春 130118）

泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）属鲤形目、鳅科、泥鳅属，温水性鱼类，食性广泛，易于驯化，具有较高的经济价值[1-2]。医学上，泥鳅还含有多种微量元素，可参与人体代谢[3]，具有益气补阳、温里平肝及清热活血等作用[4]。近年来，我国多采用高密度养殖模式饲养泥鳅，不当的技术操作和水质环境的恶化极容易导致泥鳅生长、免疫性能降低和应激反应，其中以出血病与细菌性烂鳃病最为常见[5-6]。随之防腐剂和抗生素的滥用也逐渐出现弊端[7]。因此，解决养殖水产动物病害防治和水体药物残留这一难题关键是寻找一种安全、可靠且绿色的替代品，目前越来越多研究表明原花青素具有该潜力。左晟希[8]通过在饲料中添加葡萄籽原花青素发现原花青素可提高肉鸡的免疫能力；Mu等[9]研究发现原花青素可以通过提高羔羊的能量代谢、氨基酸代谢、抗氧化代谢和抑制花生四烯酸代谢来缓解饲喂高精料饲料导致的结肠上皮炎症反应；Wang 等[10]发现在饲料中添加花生衣原花青素能够提高美洲鳗鲡幼鱼（Anguilla rostrata）的增重和饲料利用率。原花青素（Oligomeric proanthocyanidins，OPC）以低聚体形式广泛存在于各种植物中，具有促生长、抗氧化及抗炎等功效，是安全性极高的新型饲料添加剂[11]。虽然，OPC 是当下具有研究潜力的天然植物提取物添加剂之一，但其对泥鳅生长、免疫功能及抗氧化能力影响的相关研究尚未涉及。因此，本研究以泥鳅为研究对象，探究在饲料中添加不同水平的OPC对泥鳅生长、免疫功能以及抗氧化能力的影响，为泥鳅的绿色养殖和水产养殖业中OPC的科学应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及饲料

将泥鳅暂养于水族箱中，驯化14 d，期间投喂基础饲料。基础饲料中以鱼粉为蛋白源，其配方和营养水平见表1。分别在基础饲料中添加0、100、200、400、800 mg/kg 的OPC（纯度95%）[分别记为对照（CON）、OPC100、OPC200、OPC400、OPC800 组]。饲料原料经处理后制成直径为1.5 mm的颗粒。

表1 试验饲料配方及营养水平（干物质基础，%）

1.2 试验设计及饲养管理

试验于吉林农业大学水产养殖实验室进行，暂养结束后，选取健康且体型一致的泥鳅300 尾，初始体重为（2.13±0.01） g，随机分配至5 个组中的15 个鱼桶（每组3 个重复，每桶20 尾鱼）。每天分别在09：00、16：00 饱食投喂2 次，饲养8 周。试验期间保持温度（23±2） ℃；pH（7.5±0.1）；氨氮＜0.5 mg/L；亚硝酸盐＜0.05 mg/L和溶解氧＞7.0 mg/L。

1.3 样品收集

饲养结束后，禁食24 h，对每桶鱼计数并称重；随机取10 尾泥鳅，采用MS-222 麻醉泥鳅后从泥鳅尾部静脉采血，4 ℃静置12 h，4 000 r/min离心15 min收集血清，-20 ℃保存待测。取泥鳅的肝脏和肠道组织于液氮中快速冷冻，-80 ℃保存待测。

1.4 生长指标测定

使用以下公式计算平均增重率、特定生长率、饲料系数、蛋白质效率、成活率、肥满度、脏体比及肝体比。

增重率（%）=100×（Wt-W0）/W0

特定生长率（%/d）=100×（lnWt-lnW0）/t

饲料系数=I/（Wt-W0）

蛋白质效率=（Wt-W0）/（I×C）

成活率（%）=100×（试验末存活鱼总数/试验初存活鱼总数）

肥满度（g/cm3）=100×Wt/L3

脏体比（%）=100×Wv/Wt

肝体比（%）=100×Wh/Wt

式中：I——摄入饲料的重量（g）；

t——试验时间（d）；

W0、Wt——分别为试验初始和结束时泥鳅的体重（g）；

C——饲料蛋白质的含量（%）；

L——体长（cm）；

Wv、Wh——分别为试验泥鳅内脏团、肝脏的重量（g）。

1.5 免疫及抗氧化相关酶测定

采用上海酶联生物科技有限公司试剂盒对血清中补体3（C3）、补体4（C4）、免疫球蛋白M（IgM）和溶菌酶（LYS）含量进行测定。采用南京建成生物技术研究所有限公司试剂盒测定肝脏和肠道中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、谷胱甘肽（GSH）活性、丙二醛（MDA）含量及血清中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）活性。测定方法均参考上海酶联试剂盒和南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒说明书[12-13]。

1.6 统计分析

采用SPSS 20.0 软件对试验数据进行单因素方差分析，用Duncan’s 法多重比较进行组间差异分析，数据用“平均值±标准误”表示，P＜0.05表示显著差异。

2 结果与分析

2.1 OPC对泥鳅生长和饲料利用的影响

由表2可知，经过8周的饲养试验后，OPC 对泥鳅的生长和饲料利用有不同程度影响，OPC200、400、800 组的泥鳅的终末体质量、增重率及特定生长率较对照组均显著升高（P＜0.05），但OPC800 组相较于OPC400 组有所下降，当OPC 添加量为400 mg/kg 时，此三项指标达到最高。所有OPC 添加组的饲料系数均显著低于对照组（P＜0.05），且在OPC200 组达到最低值，在OPC400、800组呈上升趋势。与对照组相比，蛋白质效率随着OPC 添加量的提高呈现上升后降低的趋势，其中OPC200、400 组显著高于对照组（P＜0.05），且OPC200 组达到最大值，OPC200 组蛋白质效率高于OPC800 组和OPC100 组。各组成活率与对照组相比均无显著差异（P＞0.05）。

表2 OPC对泥鳅生长和饲料利用的影响

由表3 可知，与对照组相比，所有OPC 添加组的肥满度和肝体比指标均有所下降，且OPC200 组的肝体比显著下降（P＜0.05），OPC400 组泥鳅的肥满度和肝体比均显著下降（P＜0.05），而OPC100 组和OPC800组的形体指标均无显著差异（P＞0.05）。

表3 OPC对泥鳅形体指标的影响

2.2 OPC对泥鳅血清生化指标的影响

由图1A 可知，OPC400 和OPC800 组泥鳅血清中的AST 含 量 均 显 著 低 于 对 照 组（P＜0.05），其 中OPC400 组 的AST 含 量 达 到 最 低 值，OPC100 组 和OPC200 组的AST 含量呈下降趋势。由图1B 可知，OPC200、400、800组泥鳅血清中的ALT 含量显著低于对照组（P＜0.05），且OPC400组出现最低值。

图1 OPC对泥鳅血清指标的影响

2.3 OPC对泥鳅免疫指标的影响

由图2A 可知，所有OPC 添加组的泥鳅血清中的C3 含量均显著高于对照组（P＜0.05），且OPC200 组C3水平显著高于OPC100 组（P＜0.05）。由图2B、2D 可知，OPC200、400、800 组的泥鳅血清中C4 和LYS 含量均显著高于对照组（P＜0.05），且随着OPC 添加量的增加泥鳅血清中C4 水平呈先上升后下降的趋势，其中400组达到最大值。由图2C可知，所有OPC添加组的IgM含量变化与对照组相比均不显著（P＞0.05）。

图2 OPC对泥鳅血清免疫指标的影响

2.4 OPC对泥鳅抗氧化能力的影响

由图3A、3B、3D 可知，在肝脏中，OPC400、800 组的CAT 及GST 活性显著高于对照组（P＜0.05），当OPC添加量为400 mg/kg时，GSH-Px在肝脏中的水平显著高于对照组（P＜0.05）；且OPC400 组的该三项指标均达到峰值；而在肠道中，OPC200、400和800组的CAT、GSH-Px 和GST 活性与对照组相比显著提高（P＜0.05），其中，OPC200 组的GSH-Px、SOD 和GST 达到最高值，OPC400 组的CAT 活性达到最高水平。由图3C 可知，与对照组相比，除OPC100 组肝脏和肠道中的SOD 活性差异不显著（P＞0.05），其余组均显著高于对照组（P＜0.05），且各组间差异均不显著（P＞0.05）。由图3E 可知，在肝脏中，除OPC100 组的GSH 活性与对照组相比无显著差异（P＞0.05），其余OPC 添加组均显著高于对照组（P＜0.05），但在肠道中所有OPC 添加组GSH 活性均显著高于对照组（P＜0.05），且OPC200组的肝脏和肠道GSH 活性达到最高。由图3F 可知，在肝脏和肠道中，各OPC 添加组的MDA 含量均显著低于对照组（P＜0.05），其中OPC400 组的肝脏和肠道中的MDA含量最低。

图3 OPC对泥鳅肝脏和肠道抗氧化指标的影响

3 讨论

3.1 OPC对泥鳅生长、饲料利用的影响

添加适量OPC在饲料中，能显著增强水生动物的生长性能、饲料利用率和蛋白质的合成。相关研究显示，适量的OPC 能够显著改善南美洲鳗鲡（Anguilla rostrata）、鲫（Carassius auratus）和杂交鲟（Acipenser baeri Brandt ♀×A.schrenckii Brandt♂）生长性能[14-16]。本研究中，与对照组相比，OPC200、400、800 组泥鳅的终末体质量、增重率及特定生长率显著提升。与本研究结果相似的，如：饲喂添加量200～600 mg/kg葡萄籽原花青素的饲料可以显著提高鲫（Carassius auratus）的增重率和特定生长率[13]；Wang 等[10]研究发现饲料中添加600～1 200 mg/kg 的花生皮原花青素能有效提高美洲幼鳗（Anguilla rostrata）终末体质量、增重率及饲料效率；Xu等[14]发现饲料中添加50、100 mg/kg的葡萄籽原花青素能够显著改善杂交鲟（Acipenser baeri Brandt ♀×A.schrenckii Brandt♂）增重率、特定生长率和饲料效率。结合以往研究可知，添加适量的原花青素能够促进营养物质吸收，从而显著改善泥鳅的生长性能。综上所述，适量的OPC对水生动物的生长性能有显著影响，但由于鱼的种类、肠道微生物群系和OPC的来源不同所需的适宜OPC量不同。

肥满度、肝体比及脏体比的高低反映了鱼类的生长状况和营养方式[15-17]。本研究发现，OPC200 组泥鳅的肝体比显著下降，OPC400 组能显著降低泥鳅的肥满度和肝体比。有研究表明，葡萄原花青素可通过降低肝脏FXR 转录因子活性来抑制小鼠脂肪积累[18]。由此可见，本研究中肥满度和肝体比降低的原因与OPC缓解鱼类肥胖表型的作用有一定关联。

3.2 OPC对泥鳅肝脏健康的影响

AST 和ALT 作为肝功能指标，正常情况下只存在于肝脏中，当组织出现病变时，组织液中的AST 和ALT 增高[19]。本试验中，OPC400、800 组AST 含量显著低于对照组，OPC200、400、800 组ALT 含量显著低于对照组和OPC100组。张波等[20]研究发现，乙醇灌胃的小鼠6 h 后分别饲喂100、300 mg/kg 的OPC 前后对照发现血清中ALT 水平显著降低；韩建鑫等[21]研究发现，100 mg/kg OPC 有效降低了玉米赤霉烯酮致肝脏损伤的小鼠体内的ALT 和AST含量。因此，在饲料中添加适量OPC能有效缓解肝脏的损伤程度。

3.3 OPC对泥鳅免疫指标的影响

OPC 作为一种国际上公认的抗炎天然添加物，能显著增强NK 细胞活性、刺激B 细胞和T 细胞的反应[22]，具有抗肠道细菌感染功能[23]，在增强动物免疫机能方面具备广阔的发展前景。C3、C4、IgM 与LYS是体液免疫的组成部分，是炎症反应的重要诊断依据[24]。本研究中，与对照组相比，所有OPC 添加组的C3 均显著提高。OPC200、400、800 组的C4 和LYS 均显著高于对照组。相关研究表明，沙棘籽原花青素可显著增强小鼠的中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬活性从而增强小鼠的免疫能力[25]。研究发现，OPC 能通过破坏细菌细胞壁、细胞膜以及菌体结构成分达到抑菌作用[26]。因此，OPC 能够增强泥鳅免疫功能的原因与其能提高免疫细胞的杀伤能力和对细菌结构的破坏有关，具体作用机制需进一步研究。

3.4 OPC对泥鳅抗氧化能力的影响

CAT、GSH-Px、SOD、GST和GSH是天然的抗氧化防御机制，MDA 水平高低是细胞受损程度的重要参数[27-28]。本研究中，OPC 添加量为400 mg/kg 时，泥鳅肝脏中GSH-Px 活性显著提升，OPC 添加量为400、800 mg/kg 时，泥鳅肝脏的CAT 和GST 活性显著提升，当OPC 添加量为200、400 mg/kg 和800 mg/kg 时，与对照组相比，泥鳅肝脏中的SOD 和GSH 活性显著提高，且肠道中的CAT、GSH-Px、SOD、GST 的活性显著提升，OPC 添加浓度为100、200、400、800 mg/kg 时，泥鳅肠道中GSH活性显著高于对照组，而肠道和肝脏中的MDA 活性相较于对照组显著降低。Kim 等[29]研究发现萘普生药物可诱导机体产生ROS，从而导致胃损伤，而饲喂80 mg/kg 黑米糠花青素能有效缓解经萘普生处理后的大鼠胃组织中CAT、SOD 和GSH-Px 水平的下降。有研究表明，饲料中添加50 mg/L 的原花青素饲喂经砷处理的小鼠，其GSH、T-AOC 和SOD 显著升高，MDA 水平显著下降[30]。卢文麒等[12]研究发现，添加300、600 mg/kg OPC能有效降低组胺胁迫下美洲鳗鲡（Anguilla rostrata）MDA 水平，同时，600 mg/kg OPC 能显著提高其GSH 活性。综上，适宜添加量的OPC 能有效降低自由基的产生从而改善机体受到的损伤，增强鱼类的抗氧化能力。

近年来，人们越来越紧密关注植物提取物用作新型饲料添加剂，而OPC研究的兴起为高度集约化养殖造成鱼类应激反应等问题提供了新的解决思路，其多样性的功能备受人们青睐。本研究结果能为泥鳅的品质健康和OPC 在水产动物的利用提供参考依据和数据支持。

4 结论

综上，分析研究饲料中添加OPC 对泥鳅生长、免疫和抗氧化功能的影响表明，饲料中添加适宜浓度的OPC 一定程度上可促进泥鳅的摄食和生长、增强其免疫功能及改善泥鳅的抗氧化能力。研究结果建议，为提高泥鳅的生长性能、免疫力和抗氧化能力可在饲料中添加200～400 mg/kg OPC。