青柏散质量标准研究*

赵慧雯，雷 丸，潘 雯，张晓莉，呼延铭，王 济，冯 斌

（军事口腔医学国家重点实验室/国家口腔疾病临床医学研究中心/陕西省口腔生物工程技术研究中心/第四军医大学口腔医院，陕西 西安 710032）

青柏散由青黛、黄柏、五倍子、龙骨、冰片和甘草6味药材组成，主要用于治疗口腔炎症及口腔溃疡。方中青黛、黄柏为君药。青黛清热解毒，降温消斑[1-2]，可消除脾胃积热、心火炽盛、阴虚火旺之疾病根源；黄柏可泻火除蒸，滋阴化湿，清热解毒[3-4]。两药共用，可消肿止痛，滋阴清热，修复黏膜。五倍子和龙骨增强君药收敛生肌、解毒消炎作用[5-6]。冰片开窍醒神，清热止痛[7-8]。甘草调和诸药，散瘀杀菌，消除口腔溃疡之标象[9]。诸药合用，治病求本，共同达到治疗目的。为使更多患者获益，我院拟对其进行制剂开发及成果转化。由于中药制剂配伍复杂，色谱学方法对其进行多指标测定，可为质量控制提供依据[10-11]。本研究旨在建立该制剂的质量标准，对青黛、黄柏进行定性鉴别及定量测定，进而保证临床用药的安全性和有效性。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪（日本Shimadzu）；CP213型电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]；DL-720型超声波清洗器（浙江象山县石浦海天电子仪器厂）；Analytic型超纯水机（英国ELGA LabWater公司）；101-2AB型电热恒温鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.2 试药 青柏散（批号：211108，211109，211110）由空军军医大学第三附属医院药剂科提供；靛蓝对照品（批号：110716-201111，纯度为98.3%）、靛玉红对照品（批号：110717-201805，纯度为99.6%）、盐酸小檗碱对照品（批号：110713-202015，纯度为85.9%）、黄柏对照药材（批号：121510-201105）均购自中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 青黛 取青柏散0.5 g，加三氯甲烷5 mL，超声处理15 min，取滤液作为供试品溶液。同法配制阴性溶液。另取靛蓝和靛玉红对照品，加三氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg和1.0 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法试验，吸取上述4种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干。结果在供试品色谱中，在与靛蓝和靛玉红对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色和浅紫红色的斑点，阴性无干扰。（见图1）

图1 青黛的TLC 鉴别图

2.1.2 黄柏 取青柏散2 g，加甲醇5 mL，超声处理30 min，取滤液作为供试品溶液。同法配制阴性溶液。另取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取黄柏对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。按照薄层色谱法试验，吸取上述4种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-冰醋酸（8∶1∶3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与黄柏对照药材色谱和盐酸小檗碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。（见图2）

图2 黄柏的TLC 鉴别图

2.2 含量测定

2.2.1 靛蓝和靛玉红含量测定

2.2.1.1 色谱条件 WondaCractODS-2 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25）；检测波长为286 nm；进样量为10 μL。

2.2.1.2 溶液的制备 （1）对照品溶液：精密称取靛蓝对照品适量，以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，制成每1 mL含935.8 μg靛蓝的溶液，作为靛蓝对照品储备液；精密称取靛玉红对照品适量，加上述溶剂制成每1 mL含51.0 μg靛玉红的溶液，作为靛玉红对照品储备液；分别从上述储备液中精密量取1 mL置10 mL容量瓶中，并用溶剂稀释至刻度，即得混合对照品溶液。

（2）供试品溶液：取青柏散粉末约0.25 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺适量，超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）20 min，放冷，加上述溶剂至刻度，取续滤液即得。

（3）阴性样品溶液：将缺青黛的阴性样品按“（2）供试品溶液”项下方法制备即得。

2.2.1.3 专属性试验 取上述3种溶液进样测定，靛蓝、靛玉红和其他组分色谱峰能达到基线分离，阴性无干扰。（见图3）

图3 靛蓝和靛玉红含量测定专属性试验HPLC 图

2.2.1.4 线性关系考察 取对照品储备液进行不同浓度稀释，以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，靛蓝、靛玉红回归方程分别为Y=38354X-33451（r=0.9999），Y=57538.0X-2804.1（r=0.9998），表明靛蓝、靛玉红分别在46.79～140.37 μg/mL、2.55～7.65 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好。

2.2.1.5 精密度试验 取混合对照品溶液（靛蓝和靛玉红质量浓度分别为93.58 μg/mL和5.10 μg/mL）连续进样测定6次，靛蓝和靛玉红峰面积RSD分别为0.32%、0.54%，表明仪器精密度良好。

2.2.1.6 稳定性试验 取供试品溶液于室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h进样测定，靛蓝和靛玉红峰面积RSD分别为0.41%、0.38%，12 h内溶液稳定性良好。

2.2.1.7 重复性试验 取青柏散6份制备供试品溶液并计算含量。靛蓝和靛玉红含量RSD分别为1.26%、0.96%，表明方法重复性良好。

2.2.1.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的青柏散6份，加靛蓝和靛玉红对照品溶液适量，制备供试品溶液，加样回收率测定结果见表1。

表1 靛蓝、靛玉红加样回收率试验结果 （n=6）

2.2.1.9 耐用性试验 取青柏散样品适量制备供试品溶液，分别考察不同检测波长（283、286、289 nm）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min），不同柱温（20、25、30 ℃）对靛蓝和靛玉红含量的影响。结果靛蓝和靛玉红含量的RSD均小于2%，表明该方法耐用性良好。

2.2.2 盐酸小檗碱含量测定

2.2.2.1 色谱条件 WondaCractODS-2 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（每100 mL水中加十二烷基磺酸钠0.1 g）（52∶48）；检测波长：265 nm；进样量：20 μL。

2.2.2.2 溶液的制备 （1）对照品溶液：精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL含71.0 μg盐酸小檗碱的溶液，即得对照品储备液。再稀释10倍即得对照品溶液。

（2）供试品溶液：取青柏散粉末约0.1 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）40 min，放冷，加甲醇至刻度，取续滤液即得。

（3）阴性样品溶液：将缺黄柏的阴性样品按“（2）供试品溶液”项下方法制备即得。

2.2.2.3 专属性试验 取上述3种溶液进样测定，盐酸小檗碱峰和其他组分峰能达到基线分离，阴性无干扰。（见图4）

图4 盐酸小檗碱含量测定专属性试验HPLC 图

2.2.2.4 线性关系的考察 取对照品储备液进行不同浓度稀释，以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，回归方程为X=95829.0X+1545.6（r=0.9998），表明盐酸小檗碱在3.55～10.65 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好。

2.2.2.5 精密度试验 取对照品溶液（质量浓度为7.10 μg/mL）连续进样测定6次，盐酸小檗碱峰面积RSD为0.40%，表明仪器精密度良好。

2.2.2.6 稳定性试验 取供试品溶液于室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h进样测定，盐酸小檗碱峰面积RSD为0.47%，12 h内溶液稳定性良好。

2.2.2.7 重复性试验 取青柏散6份制备供试品溶液并计算含量，RSD为1.84%，表明方法重复性良好。

2.2.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的青柏散6份，加对照品溶液适量，制备供试品溶液，加样回收率测定结果见表2。

表2 盐酸小檗碱加样回收率试验结果 （n=6）

2.2.2.9 耐用性试验 取青柏散样品适量制备供试品溶液，分别考察不同检测波长（262、265、268 nm）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱温（20、25、30 ℃）对盐酸小檗碱含量的影响。结果盐酸小檗碱含量的RSD均小于2%，表明方法耐用性良好。

2.2.3 样品含量测定 取青柏散3批（批号：211108，211109，211110）制备供试品溶液，含量计算结果见表3。根据2020年版《中华人民共和国药典》一部，青黛中靛蓝含量为不得少于2.0%，靛玉红含量为不得少于0.13%，黄柏中盐酸小檗碱含量为不得少于3.0%。本品按照生产工艺打粉入药收率不得少于85%计算，青柏散中靛蓝、靛玉红和盐酸小檗碱含量应分别不低于5.23、0.34、1.96 mg/g。因青黛和黄柏中药材产地及来源广泛，结合含量测定结果，拟定青柏散中靛蓝、靛玉红和盐酸小檗碱含有量分别不低于5.23、0.34、1.96 mg/g。

表3 样品含量测定结果 （mg/g，n=3）

3 讨论

薄层鉴别法是中药鉴定的主要方法，是快速分离和定性分析的一种重要实验技术[12]。本研究采用不同的溶剂和展开剂为青黛及黄柏建立了相应的鉴别方法。青黛薄层鉴别中，本试验分别以甲苯-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶1）、甲苯-甲酸乙酯-甲酸（3∶1∶0.1）、三氯甲烷-乙醇（9∶1）作为展开剂进行筛选，结果优选甲苯-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶1）。黄柏薄层鉴别中，本试验分别以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-冰醋酸（8∶1∶3∶1）、正丁醇-醋酸-水（2.0∶0.5∶1.0）和环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（3.0∶3.5∶1.0∶1.5∶0.5∶1.0）作为展开剂进行筛选，结果优选乙酸乙酯-丙酮-甲醇-冰醋酸（8∶1∶3∶1）。最终建立的方法阴性无干扰，专属性良好，展开剂制备简单易行，可用于本制剂的定性鉴别。

高效液相色谱法可用于分析80%以上的有机物，特别是高沸点、大分子、热稳定性差的有机化合物。中药制剂检测一般对具有生理活性的化学成分进行质控，以衡量产品是否达标。故本研究通过高效液相色谱法中的反相键合相色谱法对君药青黛中的靛蓝和靛玉红及黄柏中的盐酸小檗碱进行了含量测定。其中靛蓝和靛玉红互为同分异构体，属双吲哚类生物碱。小檗碱属季铵生物碱。生物碱呈环状结构，可与酸形成盐。HPLC法可精准测定生物碱成分[13-14]。

本研究在靛蓝和靛玉红含量测定中考察了不同的提取溶剂如甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺及2%水合氯醛甲醛溶液等多种有机溶剂[15-17]对提取效果的影响，发现N，N-二甲基甲酰胺对靛蓝和靛玉红两种有效成分溶解最为完全，提取效果最好，从而可以满足同时测定两种成分的要求；盐酸小檗碱的含量测定中考察了甲醇、乙腈、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、50%乙醇-盐酸等对提取效果的影响，发现以甲醇提取效果最好。本试验流动相的选择中考察了甲醇-水（75∶25）、乙腈-水（75∶25）、甲醇-0.1%磷酸（75∶25）、乙腈-0.1%磷酸（75∶25）、甲醇-0.02 mol/L乙酸铵（75∶25）对靛蓝和靛玉红色谱峰的影响[18-20]，结果发现以甲醇-0.1%磷酸（75∶25）为流动相时峰形对称，分离度好，制备方法简捷；本试验考察了乙腈-0.5%磷酸二氢钾（35∶65）、乙腈-0.1%磷酸溶液（52∶48）对盐酸小檗碱色谱峰的影响[21-23]，结果发现直接选择磷酸或磷酸二氢钾的乙腈溶液作为流动相时，色谱峰峰形拖尾。在0.1%磷酸中加入适量表面活性剂十二烷基磺酸钠，可有效改善系统适应性参数，解决拖尾问题。本研究最终建立的HPLC法分析结果合理，数据模型可靠，方法回收率高，可用于本制剂的定量测定。

青柏散为纯中药制剂，具有促进溃疡愈合和镇痛双重作用。随着生活节奏加快，口腔溃疡发病率逐渐提高。口腔溃疡长期反复发作严重影响患者日常生活，且灼痛难忍及迁延难愈等特点，给患者带来生理和心理困扰。口腔溃疡发病与饮食因素、精神因素、遗传因素等各种原因相关。特别是对于免疫力低下的人群，仅仅环境或季节的变化即会造成溃疡复发，然而尚未有明确研究证实其发病机制。目前针对口腔溃疡的西药治疗多以缓解症状为主，治疗药物有激素类、局麻类、抗炎抑菌类、促进创面愈合类等，但治疗后复发率高，且激素类药物长期应用还会影响患者的免疫力。此外，针对口腔溃疡治疗的外用药物剂型主要包括溶液剂、膜剂、软膏剂、凝胶剂和散剂等，然而溶液剂与口腔接触时间较短，往往还未达到有效利用度即被唾液冲刷。膜剂放入口腔会产生较强的异物感，容易掉落而无法起效。软膏剂和凝胶剂吞咽风险较大，从而引发安全性问题。因此将药物制备成散剂患者依从性较好，安全性较高。我院在《千金要方·口疮》中记载的青黛、黄柏基础上添加收湿敛疮、镇痛止血的五倍子，镇惊安神、收敛固脱的龙骨，清热止痛、防腐生肌的冰片，以及补脾益气、缓急止痛的甘草，并采用现代工艺将其制备成散剂。以上中药协同作用，标本兼治。同时各味药材来源广泛，配伍和制备工艺简单。本研究依据色谱学方法为其建立质量标准，可为青柏散的质量控制提供依据。