三七皂苷R1对脑缺血再灌注诱导焦亡的影响*

安喆妮，文海韬，石雅宁，3，覃 丽，4

（1.湖南中医药大学药学院干细胞中药调控与应用实验室，湖南 长沙 410208；2.湖南省儿童医院，湖南 长沙 410007；3.湖南中医药大学科技创新中心，湖南 长沙 410208；4.血管生物学与转化医学湖南省高校重点实验室，湖南 长沙 410208）

缺血性脑卒中是因各种诱发因素引起的脑动脉狭窄、闭塞或破裂，造成急性脑血液循环障碍，从而导致局部脑组织缺血性坏死或软化[1]。缺血再灌注损伤是脑卒中致死、致残的重要病理生理基础[2]。细胞焦亡（pyroptosis）是一种与炎症反应密切相关的程序性细胞死亡形式，主要表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物释放进而激活强烈的炎症反应[3]。NOD样受体（NOD-like receptor）可直接或间接通过接头蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD）招募半胱天冬蛋白酶的前体pro-Caspase-1形成NLRP3炎症小体[4]。NLRP3/Caspase-1信号通路介导了焦亡的发生，抑制焦亡可对脑缺血再灌注损伤起保护作用[5]。

三七皂苷R1是在三七中发现的特有达玛烷型皂苷，具有保护心血管系统、中枢神经系统、免疫系统以及抗癌、抗炎、改善微循环等作用[6-7]。研究表明三七皂苷R1与黄芪甲苷合用可抑制脑缺血再灌注后神经细胞凋亡[8]。三七皂苷R1可降低脑组织中TNF-α的浓度，减少细胞凋亡[9]。但是三七皂苷R1是否通过抑制焦亡而发挥抗脑缺血再灌注损伤还不清楚。本研究进一步研究了三七皂苷R1对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，并从抗焦亡的角度探讨可能的作用机制，旨在为三七皂苷R1的进一步开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 三七皂苷R1（批号：180506322）购自美国Sigma公司。HE染色液（批号：G1120）、Nissal染色液（批号：G1436）均购自北京索莱宝科技有限公司。β-actin（批号：18C03A27）、NLRP3（批号：BA-3677-2）抗体均购自博士德生物公司；Caspase-1抗体（批号：GR3285543-7）、GSDMD抗体（批号：GR45463-1）均购自英国abcam公司；白介素-18（IL-18）ELISA测定试剂盒（批号：SEKR-0054）购自北京索莱宝科技有限公司；白介素-1β（IL-1β）ELISA检测试剂盒（批号：1151911323）购自博士德生物公司；RIPA裂解液（批号：P0013C）、BCA法蛋白定量试剂盒（批号：16E25C46）购自博士德生物技术有限公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（批号：011821210312）、ECL发光液（批号：071119200206）均购自上海碧云天生物技术有限公司；依达拉奉（批号：141109）购自昆明积大制药有限公司；戊巴比妥钠（批号：AM00469）购自北京化学试剂公司。

1.2 主要仪器 组织破碎匀浆机（武汉赛维尔生物科技有限公司，型号：KZ-Ⅱ）；倒置荧光显微镜（德国蔡司股份公司，型号：ZEISS，Axio Vert A1）；蛋白电泳仪（美国伯乐生命医学产品有限公司，型号：Mini-PROTEAM Tetra 1658001）；电子分析天平（德国赛多利斯股份公司，型号：BT-124S）；烤箱（上海惠泰仪器制造有限公司，型号：DHG-9140A）；全波长酶标仪（赛默飞生物有限公司，型号：Multiskan SkyHigh）；石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016）。

1.3 实验动物 SPF级SD大鼠70只，体质量（243.6±4.8）g，购自湖南斯莱克景达实验动物中心，动物生产及使用许可证号：SCXK（湘）2016-0002。所有实验动物均饲养于湖南省儿童医院动物实验室，大鼠适应性喂养1周，自由进食与饮水，饲养条件为温度（25±2）℃，通风良好，空气湿度40%～60%，明暗12 h/12 h交替，环境安静，所有动物实验均符合湖南省儿童医院伦理委员会的规定，动物实验伦理批准号：DW2022-05。

1.4 动物分组、给药及造模 将70只SPF级大鼠适应性喂养1周后，随机分为7组，分别为对照组、假手术组、模型组、三七皂苷R1低剂量组、三七皂苷R1中剂量组、三七皂苷R1高剂量组及依达拉奉组，每组10只。三七皂苷R1低、中、高剂量组大鼠予低[25 mg/（kg·d）]、中[50 mg/（kg·d）]、高[100 mg/（kg·d）]剂量[10-11]三七皂苷R1混悬液灌胃，连续给药7 d。称取适量的三七皂苷R1，用0.5%的羧甲基纤维素钠配制成质量浓度为2.5、5.0、10.0 mg/mL的混悬液，并按10 mL/kg的体积进行灌胃给药。依达拉奉组大鼠腹腔注射给予依达拉奉[3 mg/（kg·d）]，连续给药7 d。对照组、假手术组、模型组灌胃相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠。7 d后，除对照组和假手术组外，所有大鼠行大脑中动脉阻断（MCAO）[12]。具体如下：大鼠用戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，颈部正中切开，暴露并分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。结扎颈总动脉及颈外动脉，用止血夹暂时夹闭颈内动脉。于颈总动脉剪一小口，将栓线插入至颈内动脉。阻断血流2 h后，拔出栓线实现再灌注，缝合皮肤。假手术组大鼠只行术前麻醉和血管分离术，不结扎及插入线栓。再灌注24 h后处死动物，收集脑组织。

1.5 观察指标

1.5.1 神经功能学评价 采用Zea-Longa法进行神经功能评价[13]。神经功能损伤评分标准如下。0分：无神经损伤体征；1分：不能完全伸展对侧前肢；2分：爬行时向右旋转转圈；3分：爬行时向对侧明显倾倒；4分：无法自发行走和丧失意识，得分越高，神经损伤越严重。

1.5.2 脑含水量 取新鲜脑组织，去除嗅球、小脑和低位脑干，分离左右大脑半球，立即称湿质量，然后放入110 ℃烤箱中24 h烤干，迅速称脑组织干质量，计算脑含水量。脑含水量（%）=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

1.5.3 脑组织病理变化 脑组织用4%的多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋后制备5 μm石蜡切片，脱蜡后依次加入无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中5 min，用蒸馏水冲洗使切片水合。最后用HE染色液或尼氏（Nissl）染色液37℃染色10 min，蒸馏水洗涤3次，常规脱水透明后，用中性树脂封片，在光镜下观察并拍照。

1.5.4 神经细胞死亡情况 采用TUNEL染色检测神经细胞死亡情况。脑组织石蜡切片，脱蜡后，将切片依次放入无水乙醇、90%乙醇、70%乙醇2 min，浸入PBS漂洗2次，5 min/次。然后加入20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K工作液，于37 ℃孵育30 min。PBS漂洗3次，5 min/次。滴加50 μL的TUMEL检测液，37 ℃避光孵育1 h。最后浸入PBS漂洗2次，5 min/次，滴加DAPI抗荧光猝灭剂二合一封片剂，荧光显微镜下观察。

1.5.5 脑组织炎症因子 取100 mg脑组织加入0.4 mL匀浆液后用组织匀浆机打碎（60 Hz，60 s），12000 r/min（离心半径8.6 cm），4 ℃，离心15 min，取上清液。严格按照ELISA检测试剂盒说明书检测上清液中IL-1β和IL-18水平。

1.5.6 脑组织NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白表达水平 采用Western blotting法检测脑组织NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白相对表达量。取100 mg脑组织加入1 mL RIPA蛋白裂解液、10 μL丝氨酸蛋白酶及巯基蛋白酶抑制剂，组织匀浆机打碎，冰浴30 min，随后在4 ℃、12000 r/min（离心半径8.6 cm）条件下离心15 min。取上清液，BCA法检测蛋白浓度并变性。配制10% SDS-PAGE电泳分离胶，每个凝胶孔中加入30 μg蛋白样品，80 V恒压电泳30 min后120 V恒压电泳1 h。电泳完成后将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂奶粉室温下封闭非特异性抗原1 h；加一抗（β-actin抗体、NLRP3抗体、GSDMD抗体和Caspase-1抗体，1∶500）4 ℃孵育过夜。用TBS-T洗膜3次；加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5000），37 ℃摇床1 h；TBS-T洗膜3次，ECL发光液显影成像，检测NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白表达水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，数据服从正态分布，同时方差齐用单因素方差分析，然后进行Tukey检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能损伤评分及脑含水量比较 模型组大鼠神经功能损伤评分及脑含水量高于假手术组（P＜0.01）。三七皂苷R1中、高剂量组及依达拉奉组大鼠神经功能损伤评分及脑含水量均低于模型组。（见图1）TUNEL染色结果显示三七皂苷R1中、高剂量组脑组织神经细胞死亡数量低于模型组。三七皂苷R1高剂量组对缺血再灌注诱导脑损伤的保护作用与阳性对照药物依达拉奉的效果相似。（见图2）

图1 各组大鼠神经功能损伤评分及脑含水量比较（±s，n=10）

图2 脑组织TUNEL 染色病理图 （×400）

2.2 脑组织HE染色、Nissl染色结果 HE染色显示：模型组大鼠脑组织空泡化及组织坏死明显高于假手术组，三七皂苷R1中、高剂量组大鼠脑组织损伤程度明显低于模型组。（见图3）Nissl染色显示：模型组大鼠脑组织中神经元尼氏体的数量明显低于假手术组，而三七皂苷R1中、高剂量处理组大鼠脑组织中神经元尼氏体的数量明显高于模型组。（见图4）结果表明三七皂苷R1对大鼠缺血再灌注诱导的脑损伤具有保护作用。

图3 脑组织HE 染色病理图 （×400）

图4 脑组织Nissl 染色病理图 （×400）

2.3 各组大鼠脑组织IL-18和IL-1β水平比较 模型组大鼠脑组织IL-18、IL-1β水平高于假手术组（P＜0.01）；三七皂苷R1中、高剂量组及依达拉奉组大鼠脑组织IL-18、IL-1β水平均低于模型组（P＜0.01或P＜0.05）。（见图5）结果表明三七皂苷R1可抑制脑缺血再灌注诱导炎症反应。

图5 各组大鼠脑组织IL-18、IL-1β 水平比较 （±s，n=10）

2.4 各组大鼠脑组织中NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白相对表达量比较 模型组大鼠脑组织中NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白相对表达量高于假手术组（P＜0.01）；三七皂苷R1中、高剂量组及依达拉奉组大鼠脑组织中NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白相对表达量低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。（见图6～7）结果表明三七皂苷R1对脑缺血再灌注诱导的焦亡激活有抑制作用。

图6 各组大鼠脑组织中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达Western blotting 图

图7 各组大鼠脑组织中NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白相对表达量比较 （±s，n=10）

3 讨论

脑卒中是目前严重危害人类，导致死亡和残疾的三大重要疾病之一。据世界卫生组织的统计，每年全球范围内死于该病的人数达620万[14]。我国脑卒中的发病率也逐年上升，据《〈中国脑卒中防治报告2019〉概要》报道，我国40～74岁居民首次脑卒中标化发病率平均每年增长8.3%，现患人数约为1318万例，每年有190多万人因脑卒中死亡[15]。缺血再灌注诱导的神经细胞过度氧化应激、炎症反应、兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载以及细胞死亡信号通路的激活都可导致神经细胞死亡[16-17]。随着溶栓治疗技术的不断发展，在疾病初期及时进行再灌注治疗，可有效改善病情转归[18]。但研究发现再灌注治疗时存在一定程度的缺血再灌注损伤，导致脑组织结构和神经功能损伤，增加致残致死风险[19]。因此降低脑缺血再灌注损伤对脑卒中患者至关重要。

三七皂苷R1为三七中的活性物质之一，在保护心脑血管损伤中有重要作用。研究表明三七皂苷R1可通过Akt/Nrf2信号通路抑制NADPH氧化酶活性和线粒体功能障碍，实现神经保护作用[20]。三七皂苷R1还是一种促神经源性化合物，可通过BDNF/Akt/CREB途径促进神经发生，改善脑缺血/再灌注损伤[8]。本实验在MACO模型中进一步评价了三七皂苷R1对脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。研究结果表明三七皂苷R1可缓解脑缺血再灌注诱导的脑损伤，改善神经功能损伤评分和脑水肿。高剂量三七皂苷R1对脑损伤的保护作用与阳性对照药物依达拉奉的作用程度相似，说明三七皂苷R1是具有开发前景的神经保护剂。

与细胞凋亡比较，细胞焦亡发生更快，并会伴随着大量炎症因子的释放。NLRP3炎症小体是分子量约为700 kDa的多蛋白复合体，由NLRP3、衔接蛋白ASC及效应蛋白Caspase-1组成[21]。炎症小体可将pro-Caspase-1水解为活化的Caspase-1[22]。Caspase-1进而将pro-IL-1和pro-IL-18剪切成为有生物活性的IL-1和IL-18[23]。Caspase-1还可活化GSDMD蛋白，活化的GSDMD蛋白是引起细胞焦亡的关键因素[24]。研究结果显示模型组大鼠脑组织中炎症小体组成物NLRP3及效应蛋白Caspase-1相对表达量高于假手术组，Caspase-1的水解产物IL-1、IL-18以及GSDMD相对表达量也明显高于假手术组。三七皂苷R1预处理大鼠可降低脑缺血再灌注诱导的NLRP3、GSDMD和Caspase-1蛋白表达升高，同时能抑制IL-1和IL-18水平升高。结果表明三七皂苷R1可抑制脑缺血再灌注诱导的焦亡激活，但是其机制还需要进一步研究。

综上所述，三七皂苷R1能抑制缺血再灌注诱导的脑损伤，降低脑组织中焦亡标志蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1和IL-18的表达。结果表明三七皂苷R1可通过抑制细胞焦亡而发挥抗脑缺血再灌注诱导的损伤。